MicroRNA-126對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　隨著生活節(jié)奏的加快，生活水平的提高，在人們的生活方式發(fā)生巨大變化的同時(shí)，代謝性疾病的發(fā)病率也在全世界范圍內(nèi)逐年攀升，其中糖尿病是代謝性疾病中最常見的一種。在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，肝臟、肌肉、脂肪等組織對(duì)胰島素反應(yīng)能力下降甚至抵抗胰島素的作用，繼而會(huì)引起一些如肥胖、多囊卵巢綜合癥、高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。肝臟是糖代謝的重要器官，胰島素主要通過胰島素受體底物（IRS）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)/蛋白激酶B

2、（Akt）信號(hào)傳導(dǎo)通路影響肝臟的糖代謝，然而肝臟胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制，目前仍不明確。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類短小的、非編碼的微小RNAs，對(duì)維持機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)的平衡、疾病的產(chǎn)生和發(fā)展過程中有著重要影響，它們與靶信使RNA( mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-UTRs)結(jié)合，抑制編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。MicroRNA-126不僅在內(nèi)皮細(xì)胞中含量豐富，在凋亡小體中的表達(dá)也很高，國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病動(dòng)物模型以

3、及在糖尿病患者的血漿中，MicroRNA-126的表達(dá)量明顯降低，因此我們認(rèn)為MicroRNA-126可能與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有聯(lián)系。Regazzi等人提出MicroRNAs不僅可以作為早期疾病發(fā)生的標(biāo)志物，而且還可以是細(xì)胞間傳遞信息的信使，導(dǎo)致疾病進(jìn)展的原因，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)MicroRNA-126對(duì)肝細(xì)胞糖代謝影響的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　目的：
　　本研究通過對(duì)來源于肝臟的永生非腫瘤細(xì)胞系——張氏肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染MicroRNA-12

4、6類似物、抑制物及其陰性對(duì)照序列，改變細(xì)胞內(nèi) MicroRNA-126的表達(dá)量，并測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白（ IRS-1、PIK3R2、Akt-2、p-Akt-2）的表達(dá)水平，旨在探討MicroRNA-126對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝功能影響的機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1．用含有10％胎牛血清、1%青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)張氏肝細(xì)胞（Chang liver cell），置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5、
　　2.熒光顯微鏡下確定細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的張氏肝細(xì)胞以5×105/孔接種于24孔板中，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%時(shí)，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染不同濃度（20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L）的熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列（FAM-NC及inhibitor FAM-NC），6小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度，確定細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　3．將研究對(duì)象分為6組：Micro

6、RNA-126類似物組、MicroRNA-126抑制物組、MicroRNA-126類似物陰性對(duì)照組、MicroRNA-126抑制物陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組和正常對(duì)照組。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將人工合成核苷酸序列（MicroRNA-126類似物、MicroRNA-126抑制物、MicroRNA-126類似物陰性對(duì)照物、MicroRNA-126抑制物陰性對(duì)照物）分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)組細(xì)胞中，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（quanti

7、tative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中MicroRNA-126的相對(duì)表達(dá)量。
　　4．運(yùn)用Western blot法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇激酶p85β(PIK3R2)、蛋白激酶B-2（Akt-2）、磷酸化Akt-2(p-Akt-2)的蛋白表達(dá)水平。
　　5．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析由 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)

8、結(jié)果由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，并用單因素方差分析（one-way ANOVA）及t檢驗(yàn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的轉(zhuǎn)染張氏肝細(xì)胞，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，80 nmol/L為最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　2．在MicroRNA-126類似物組中，細(xì)胞內(nèi)M

9、icroRNA-126的相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增加（P<0.05）；其他組細(xì)胞中MicroRNA-126的相對(duì)表達(dá)量與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3．在MicroRNA-126類似物組細(xì)胞中IRS-1、PIK3R2的相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），其余各組細(xì)胞中IRS-1、PIK3R2的相對(duì)表達(dá)量間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MicroRNA-126類似物組細(xì)胞 Akt-