S100P在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本研究分析比較125例腫瘤發(fā)展不同階段結(jié)腸腺癌的臨床手術(shù)標(biāo)本中S100P的表達(dá)差異，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。并利用S100P敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株分析S100P在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制。
　　1、免疫組化檢測人結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本S100P表達(dá)情況
　　腺癌是消化道腫瘤中最為常見多發(fā)的病理類型。為了更好探尋S100P表達(dá)量與結(jié)直腸進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系，我們利用免疫組化技術(shù)對125例不同臨床分期的結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)

2、本及其配對手術(shù)切緣正常結(jié)腸組織進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中S100P表達(dá)量顯著高于正常組織。利用統(tǒng)計學(xué)檢驗分析腫瘤組織中S100P表達(dá)量與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性后，我們發(fā)現(xiàn)S100P的表達(dá)高低與患者術(shù)前血中CEA(x2=9.704，P=0.002)、CA19-9(x2=5.051，P=0.025)，腫瘤大小(x2=4.098，P=0.043)，N分期(x2=1.033，P=0.309)，M分期(x2=36.863，P＜0.001)，TNM分期(x

3、2=13.528，P＜0.001)存在相關(guān)性。在收集患者術(shù)后隨訪信息后，對S100P表達(dá)情況與患者生存時間進(jìn)行生存分析后，我們發(fā)現(xiàn)S100P高表達(dá)的患者預(yù)后顯著低于S100P低表達(dá)的患者(x2=30.080，P＜0.001)。通過建立多因素COX風(fēng)險預(yù)測模型，對S100P表達(dá)量與不同臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析后，結(jié)果顯示S100P（hazards ratio，HR=2.697，P＜0.001）、TNM分期(HR=3.678，P＜0.001)可

4、被視為患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。S100P在腫瘤中的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤較高的轉(zhuǎn)移能力以及不良預(yù)后。
　　為了進(jìn)一步驗證S100P基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，我們利用Q-PCR和Western blot技術(shù)對臨床結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本中S100P的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織中S100P基因的mRNA表達(dá)量約為正常組織中的3倍之多(t=7.704,P＜0.001)，結(jié)腸癌組織中S100P蛋白表達(dá)量亦是顯著高于正常結(jié)直腸組織(t=4

5、.739，P=0.018)。
　　2、S100P在結(jié)腸癌中所發(fā)揮的作用
　　為探尋S100P在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，選取合適的體外研究對象，我們對6種不同結(jié)腸癌細(xì)胞系:LS174T、SW480、HCT116、SW620、LOVO、DLD-1的S100P基因及蛋白表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示LS174T、HCT116、DLD-1相對于SW480、SW620、LOVO為S100P高表達(dá)細(xì)胞株。結(jié)合細(xì)胞狀態(tài)及其生長情況，最終我們選取了

6、S100P高表達(dá)的LS174T、HCT116細(xì)胞株作為我們的研究對象。
　　本研究利用siRNA干擾技術(shù)，設(shè)計針對S100PmRNA不同的siRNA，通過Q-PCR和Western blot檢測，篩選S100P干擾效率最高的siRNA，并根據(jù)其設(shè)計表達(dá)S100P-siRNA及綠色熒光(GFP)的慢病毒。利用表達(dá)S100P-siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T、HCT116，構(gòu)建S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T

7、-S100P-KD、HCT116-S100P-KD。利用S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株，在體外對細(xì)胞的侵襲性、遷移性進(jìn)行了檢測。通過對裸鼠的皮下成瘤及腹腔內(nèi)注射，構(gòu)建動物腫瘤模型及腹腔內(nèi)播散模型。觀察S100P表達(dá)在體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞成瘤性及轉(zhuǎn)移性的影響。
　　3、S100P促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的初步探討
　　研究表明，S100P可外分泌至細(xì)胞間質(zhì)，再與細(xì)胞膜表面蛋白RAGE結(jié)合，繼而激活下游MAPK/ERK信號通路，

8、使得Erk1/2磷酸化，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。另有報道證實，MAPK/ERK信號通路與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)存在密切聯(lián)系。而EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要機(jī)制之一，也是當(dāng)今腫瘤分子機(jī)制研究的熱門。在研究過程中，S100P與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。
　　利用構(gòu)建的S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T-S100P-KD、HCT116-S100P-KD，通過Western blot檢測S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)

9、結(jié)腸癌細(xì)胞株及陰性對照細(xì)胞株中S100P、RAGE、Erk1/2、p-Erk1/2、上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Snail的表達(dá)差異。在敲低S100P表達(dá)量后，相比未敲低S100P的陰性對照組，細(xì)胞株中RAGE及磷酸化Erk1/2的表達(dá)量隨之下降，腫瘤細(xì)胞株的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)量也出現(xiàn)下降，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Snail

10、的表達(dá)量則出現(xiàn)了上升。初步證實了，S100P激活RAGE/ERK信號通路，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程。
　　4、篩選及驗證S100P上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子
　　基因的表達(dá)受到體內(nèi)多種方式的調(diào)控，其中基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生于轉(zhuǎn)錄過程中，調(diào)控過程圍繞著轉(zhuǎn)錄過程，如轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。真核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄需要多種蛋白因子協(xié)助，其中轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor，TF)是一群能與DNA特定序列特異性結(jié)合，

11、從而促進(jìn)或是抑制目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵因子。
　　SOX(sex determining region Y box)家族是具有HMG盒的一類與性腺發(fā)育有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，包括A～J10個亞家族。研究發(fā)現(xiàn)，SOX家族與癌癥發(fā)生有密切聯(lián)系，包括黑色素瘤、胃癌、髓母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。SOX9最早是從一種性別反轉(zhuǎn)畸形的遺傳性疾病患者中克隆得到。近來，SOX9與腫瘤的關(guān)系也開始受到關(guān)注。
　　為驗證SOX9

12、為S100P的轉(zhuǎn)錄因子，我們首先檢測SOX9與S100P在相同結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果證明，SOX9與S100P在結(jié)腸癌組織中均為表達(dá)升高，在高表達(dá)S100P的結(jié)腸癌細(xì)胞株中SOX9也相應(yīng)的高表達(dá)，兩者存在一定相關(guān)性。接著我們利用凝膠電泳遷移實驗(EMSA)、定量染色質(zhì)免疫共沉淀(Q-ChIP)技術(shù)(HCT116:t=3.871，P=0.018; LS174T: t=2.889，P=0.016)、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢

13、測LS174T、HCT116細(xì)胞株中SOX9與S100P基因的特異性結(jié)合情況。我們利用siRNA技術(shù)特異性干擾LS174T、HCT116細(xì)胞株SOX9表達(dá)后，觀察S100P基因表達(dá)的變化情況。
　　5、SOX9與S100P在結(jié)腸癌中表達(dá)情況的相關(guān)性分析及其在腫瘤進(jìn)展中所起的作用
　　SOX9作為S100P轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控S100P轉(zhuǎn)錄表達(dá)，SOX9在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況應(yīng)影響S100P的表達(dá)。為了驗證這一理論設(shè)想，我們利用組織芯片

14、免疫組化技術(shù)分析90例人結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本中SOX9及S100P的表達(dá)情況，并利用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示在結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本中，SOX9與S100P的表達(dá)量存在線性回歸(R2=0.782，F(xiàn)=315.459，P＜0.001)，SOX9高表達(dá)的病例中存在S100P高表達(dá)的現(xiàn)象，兩者存在線性關(guān)系。此外，高表達(dá)SOX9及高表達(dá)S100P的病例預(yù)后顯著差于低表達(dá)組。
　　我們還構(gòu)建了SOX9干擾細(xì)胞株、SOX9過表達(dá)細(xì)胞株、SOX

15、9過表達(dá)及S100P干擾細(xì)胞株以及各自的陰性對照。通過對SOX9不同表達(dá)量細(xì)胞株進(jìn)行Westernblot檢測，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的SOX9通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控S100P，導(dǎo)致S100P表達(dá)量的升高，過表達(dá)的S100P進(jìn)而激活MAPK/ERK信號通路，促進(jìn)腫瘤EMT的過程，從而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。在過表達(dá)SOX9的同時，若敲低S100P的表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)這個過程，MAPK/ERK信號通路及EMT過程仍處于抑制狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞的侵襲(t

16、=6.309，P=0.001)和轉(zhuǎn)移（t=4.769，P=0.003）能力也較SOX9過表達(dá)組大為減弱。裸鼠動物模型進(jìn)一步證實了體外細(xì)胞實驗結(jié)果。
　　結(jié)論:
　　1、S100P在結(jié)腸癌組織中相比正常結(jié)直腸組織高表達(dá)。在結(jié)腸腺癌中，S100P的表達(dá)量與患者血液中CEA、CA19-9的水平、瘤體大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM臨床分期相關(guān)。S100P表達(dá)量、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況可被視為患者生存預(yù)后的獨立預(yù)測因子。S100P高表達(dá)預(yù)示

17、著腫瘤較強的轉(zhuǎn)移能力及不良預(yù)后。
　　2、S100P促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移及成瘤能力。
　　3、S100P通過激活RAGE/ERK信號通路，繼而促進(jìn)結(jié)腸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。
　　4、SOX9是S100P基因的轉(zhuǎn)錄因子，在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，是導(dǎo)致S100P結(jié)腸癌中高表達(dá)的原因之一。通過干擾SOX9表達(dá)，可以影響S100P的表達(dá)，SOX9對S100P基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。