基于組織表達(dá)譜的結(jié)直腸癌相關(guān)長鏈非編碼RNA的篩選和驗(yàn)證.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。2012年全世界新發(fā)結(jié)直腸癌病例數(shù)為136萬，因結(jié)直腸癌死亡的人數(shù)約69萬人。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率較以前顯著上升。近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率的上升趨勢有所放緩，但是由于其發(fā)病隱匿、預(yù)后不良，給人民生活造成了較大的負(fù)擔(dān)。因此，結(jié)直腸癌仍然是嚴(yán)重威脅我國居民健康的重大問題。
　　長鏈非編碼RNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度介于200nt-100kb之

2、間的不編碼或很少編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中存在lncRNAs的異常表達(dá)，而IncRNAs中特定的超保守元件在人類腫瘤細(xì)胞中存在著廣泛表達(dá)。已有較多的研究者利用lncRNA表達(dá)譜芯片，對腫瘤當(dāng)中的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了一些與腫瘤密切相關(guān)的lncRNA。但是，目前此類研究仍存在著一些不足之處。首先，現(xiàn)有關(guān)于結(jié)直腸癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜分析研究數(shù)量較少。其次當(dāng)前研究單獨(dú)利用lncRNA表達(dá)水平來篩選的lncR

3、NA，作用機(jī)理的闡述往往無從下手。最后，當(dāng)前的腫瘤相關(guān)長鏈非編碼RNA篩選策略并未考慮到不同基因之間的相互作用。
　　本研究擬從結(jié)直腸癌的lncRNA表達(dá)譜入手，利用表達(dá)差異分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析兩種篩選策略，分別篩選與結(jié)直腸癌相關(guān)的lncRNA，并在表達(dá)水平上對篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證，以期望篩選出在結(jié)直腸癌中具有生物學(xué)功能的lncRNA。
　　材料與方法：
　　收集2013年5月到2013年12月期間

4、確診為結(jié)直腸腺癌96例臨床病例，采集其手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，并從中選擇6對組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜芯片檢測。在差異表達(dá)的lncRNA當(dāng)中，選取表達(dá)差異穩(wěn)定（在6對lncRNA當(dāng)中表達(dá)差異均大于1.5)倍數(shù)最大的10個lncRNA（上調(diào)/下調(diào)各5個）作為差異表達(dá)lncRNA。利用lncRNA與mRNA的表達(dá)水平信息構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建共表達(dá)模塊，并通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫GO和KEGG對構(gòu)建的共表達(dá)模

5、塊進(jìn)行功能預(yù)測，選擇具有一定功能的共表達(dá)模塊，然后篩選出模塊中與結(jié)直腸癌相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA分子。根據(jù)篩選結(jié)果，采用定量RT-PCR手段，在另外的90對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織當(dāng)中對篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)lncRNA分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。采用配對t檢驗(yàn)分析這些lncRNA相對表達(dá)變化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、結(jié)直腸癌的部位、大小、臨床分期以及分化程度等臨床特征之間的關(guān)聯(lián)情況，并通過ROC曲線分析比較各個lncRNA用于判斷組織是否癌變時的準(zhǔn)確性

6、。
　　結(jié)果：
　　lncRNA表達(dá)譜芯片檢測的30586個lncRNA中，在癌組織當(dāng)中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的lncRNA有556個，表達(dá)下調(diào)的lncRNA有1040個。26109個mRNA當(dāng)中在結(jié)直腸癌組織當(dāng)中表達(dá)上調(diào)的mRNA為889個，表達(dá)下調(diào)的977個。在這些差異表達(dá)lncRNA當(dāng)中，表達(dá)差異穩(wěn)定且變化倍數(shù)最大的10個lncRNA分別是:上調(diào)CCAT1、UCA1、RP5-881L22.5、NOS2P3、BC005081;下調(diào)

7、AK055386、AC078941.1、RP4-800J21.3、 RP11-628E19.3、 RP11-384P7.7。
　　用lncRNA與mRNA的表達(dá)水平信息構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與無尺度網(wǎng)絡(luò)的擬合度為0.813。在該網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中，通過聚類方法篩選到了9個共表達(dá)模塊，其中的4個模塊在功能預(yù)測分析的時候表現(xiàn)出基因功能的富集，所富集的基因功能為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動、染色體組分、收縮性纖維成分、細(xì)胞骨架成分等;2個模塊在3條信號傳導(dǎo)通路

8、上發(fā)生富集，分別為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)通路、細(xì)胞周期相關(guān)通路以及黏著斑信號傳導(dǎo)相關(guān)通路。這四個共表達(dá)模塊當(dāng)中分別包含了54、19、14、21個關(guān)鍵基因，最后從中篩選出在模塊內(nèi)連接度最大的lncRNA作為模塊的關(guān)鍵lncRNA納入后續(xù)的驗(yàn)證研究。最終確定的關(guān)鍵lncRNA為RP11-58A12.3、UBE2Q2P1、 SENP3-EIF4A1、 AC010226.4-2、 CTC-454M9.1。
　　通過兩種篩選策略篩選到的共15

9、個lncRNA在90對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織樣本當(dāng)中被驗(yàn)證。定量RT-PCR檢測顯示CCAT1、UCA1、RP5-881 L22.5在結(jié)直腸癌組織當(dāng)中的表達(dá)水平顯著高于配對的癌旁組織(p＜0.05)，AK055386、AC078941.1、 RP4-800J21.3、 RP11-628E19.3、 RP11-384P7.7、 RP11-58A12.3、UBE2Q2P1、SENP3-EIF4A1、AC010226.4-2、CTC-454M

10、9.1在結(jié)直腸癌組織當(dāng)中的表達(dá)水平顯著低于配對的癌旁組織(p＜0.05)，與表達(dá)譜結(jié)果一致;CCAT1以及RP5-881 L22.5在結(jié)腸癌組織當(dāng)中特異性高表達(dá)(p＜0.05)，而在直腸癌組織當(dāng)中表達(dá)水平與配對的癌旁組織之間并無顯著差異。UCA1在直腸癌組織當(dāng)中特異性高表達(dá)(p＜0.05)，而在結(jié)腸癌組織當(dāng)中的表達(dá)水平與配對的癌旁組織之間并無顯著差異。CCAT1在早中期結(jié)直腸癌組織表達(dá)顯著高于癌旁組織(p＜0.05)，而在晚期結(jié)直腸癌當(dāng)

11、中的表達(dá)與癌旁組織無顯著差異。RP5-881L22.5在早中期結(jié)直腸癌組織表達(dá)與癌旁組織無顯著差異，而在晚期結(jié)直腸癌當(dāng)中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(p＜0.05)。UCA1和RP5-881L22.5在中高分化腺癌組織當(dāng)中表達(dá)水平顯著高于配對的癌旁組織，而在低分化腺癌當(dāng)中的表達(dá)與癌旁組織無顯著差異。ROC比較分析顯示，在癌組織中下調(diào)的lncRNA用于判斷組織是否癌變時，ROC曲線下面積顯著大于表達(dá)上調(diào)的lncRNA(p＜0.001)。兩種篩選

12、策略篩選到的lncRNA第一主成分的ROC曲線下面積并無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　(1)長鏈非編碼RNA CCAT1、UCA1、RP5-881L22.5在結(jié)直腸癌組織當(dāng)中表達(dá)顯著上調(diào)，AK055386、AC078941.1、RP4-800J21.3、RP11-628E19.3、RP11-384P7.7、RP11-58A12.3、 UBE2Q2P1、 SENP3-EIF4A1、 AC010226.4-2、CTC-454M9.

13、1在結(jié)直腸癌組織當(dāng)中表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。
　　(2)CCAT1在結(jié)腸癌和早中期結(jié)直腸癌當(dāng)中特異高表達(dá);UCA1在直腸癌和中高分化腺癌及中晚期結(jié)直腸癌組織中高表達(dá);RP5-881L22.5在結(jié)腸癌和中高分化腺癌及晚期結(jié)直腸癌組織當(dāng)中高表達(dá)。
　　(3)上調(diào)的lncRNA在診斷結(jié)直腸癌時其診斷效能顯著低于下調(diào)的lncRNA;而兩種篩選lncRNA的策略篩選出來的lncRNA總體上診斷結(jié)直腸癌的效