2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩80頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領

文檔簡介

1、目的:骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)是一組起源于造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病,以外周血一系或多系細胞增多,易發(fā)生血栓和出血等并發(fā)癥,自發(fā)性向急性白血病和骨髓纖維化轉(zhuǎn)化為共同臨床特點的一類髓系增殖性疾病。
  快速、準確和全面地獲取MPN患者的DNA分子遺傳信息對于臨床研究以及指導臨床治療具有十分重要的意義。對于每個生物體來說,其基因組包含了整個生物體的遺傳信息。測序技術能夠真實

2、地反映患者基因組DNA上的遺傳信息,進而比較全面地揭示患者基因組DNA的復雜性和多樣性。1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert發(fā)明的化學降解法,標志著第一代測序技術的誕生。Sanger測序迄今為止仍是DNA測序的主流方法,但是測序速度慢、成本高、通量小使得傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要。新一代測序技術(next-generation sequencing,NGS)是一次可對幾十萬到幾百萬條D

3、NA分子進行序列測定的高通量測序技術。新一代測序技術具有速度快、準確度高、成本低、覆蓋度深和產(chǎn)出巨大等優(yōu)點,研究者可以在短時間內(nèi)對感興趣的基因進行精確定位和分析,在臨床檢測中有廣泛的應用前景。Ion TorrentPGM測序儀是一種基于半導體芯片的新一代測序技術,通過專有的大規(guī)模并行半導體感應器,對于DNA復制時產(chǎn)生的離子流,實現(xiàn)直接和實時的檢測。IonTorrent技術具有準確度高、速度快、靈活性大等優(yōu)點。目前已應用于多領域的研究,如

4、癌癥、遺傳疾病、婦嬰健康領域、血液相關疾病、微生物研究和生物學基礎研究等。
  Thermo Life公司推出的AmpliSeq建庫方案,該技術僅利用20ng樣品就可在一管中同時擴增6144種PCR片段,使科研人員能快速的分析成千上萬個目標基因。目前Thermo Life已推出了商業(yè)化Cancer Hotspot Panel,其中大多基因涉及的是實體腫瘤,其對血液系統(tǒng)疾病的研究還較少。Ion Torrent PGM測序平臺的可擴展

5、性允許研究人員可以自由的選擇感興趣的幾十甚至幾百個基因定制多重PCR引物試劑盒。通過查閱大量文獻,我們定制了MPN致病相關基因的多重PCR引物試劑盒,包括JAK2、MPL、CALR、KIT、ASXL1、IDH1、IDH2、 LNK、CBL、TET2、EZH2、DNMT3A、U2AF1、SRSF2、SF3B1、CSF3R、TP53、SOCS1、SOCS2、SOCS3、NRAS、KRAS及NEF共23種基因。本課題第一部分的目的是在于研究I

6、on Torrent PGM測序平臺及定制的MPN多重引物試劑盒在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學建立。
  結(jié)合近年來的研究,約95%~98%的PV(Polycythemia vera)、約50%~60%的ET(Essential thrombocythemia)及PMF(Primary myelofibrosis)患者存在JAK2突變,約4%的ET患者及8%的PMF患者存在MPL突變,CALR突變在PV患者中罕見,在ET患者中

7、的突變率約為15%-24%,在PMF患者中的突變率約為25%-35%左右。然而,仍有15%的MPN病人不存在以上三種突變,此類MPN歸類于三陰性MPN。目前對于三陰性的MPN,因為缺乏三種主要的分子學突變,造成其診斷困難。本課題第二部分的目的在于研究三陰性MPN患者的分子學異常,通過新一代測序技術獲得三陰性MPN疾病相關基因序列信息,為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)。
  方法:
  1、篩選目的基因、定制MPN多重PCR引物試劑盒利

8、用Ion AmpliSeq Designer引物設計工具,對通過查閱大量文獻獲得的23個目標基因進行多重PCR引物設計,定制MPN多重PCR引物試劑盒。
  2、DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書操作,提取骨髓細胞DNA。
  3、Sanger測序用經(jīng)典的Sanger測序方法檢測MPN患者的MPL基因突變情況。
  4、Ion Torrent PGM測序
  1)文庫構(gòu)建檢測DNA濃度,加無酶水稀釋到10ng/

9、ul。按照試劑盒說明書操作,擴增目的基因DNA、消化引物、加barcode接頭、純化擴增文庫,最后定量文庫。
  2)模板制備分別在Ion OneTouch Two和Ion OneTouch ES儀器上進行乳液PCR和陽性模板富集。
  3) Ion Torrent PGM測序?qū)⒅苽涞哪0寮又罥on316芯片上,在PGM測序儀上測序,測序原始數(shù)據(jù)儲存在Ion Torrent PGM服務器上,用ionreporter(ionr

10、eporter.thermofisher.com)軟件對結(jié)果進一步分析。
  結(jié)果:
  1、Ion Ampliseq Designer設計MPN多重PCR引物
  用Ion Ampliseq Designer對23個MPN致病相關基因設計多重PCR引物,結(jié)果如下:該MPN panel大小為52.42kb,共有283個擴增子,可以覆蓋97.28%的目標區(qū)域,PCR擴增在兩管內(nèi)完成,分別有145和138個擴增子,擴增子的

11、長度在125bp和275bp之間。
  2、Sanger檢測MPL突變情況
  對第一部分和第二部分共20例MPN患者的MPL基因進行Sanger測序,20例MPN患者MPL基因突變均為陰性。
  3、Ion Torrent PGM測序質(zhì)控
  以一張316芯片為例,芯片中磁珠覆蓋率為66%,產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)236Mb。磁珠文庫連接率為100%,其中33%磁珠連接多克隆文庫,67%磁珠連接單克隆文庫。所有單克隆文

12、庫中,除去1%測試片段,12%接頭二聚體,10%低質(zhì)量文庫,最終有效單克隆文庫為77%,有效讀取片段共2,159,538個。片段平均讀長為181bp,中位讀長為196bp。不同位置的堿基平均讀取準確度為99.3%。其中達到AQ20(與參考序列99%匹配)標準的數(shù)據(jù)為207Mb。Ion TorrentPGM測序質(zhì)量標準為:磁珠覆蓋率>60%,磁珠文庫連接率>80%,連接多克隆文庫磁珠<40%,測試片段<5%。整張芯片測序質(zhì)控達到Ion T

13、orrent PGM測序質(zhì)量標準。以樣品P1為例,單個樣品測序質(zhì)控結(jié)果顯示:讀取71,322,697個堿基,能達到AQ20標準的堿基數(shù)為64,123,648,平均測序深度為1,302×。
  4、Ion Torrent PGM測序結(jié)果分析
  1)對10例已經(jīng)用Sanger測序法檢測JAK2、MPL和CALR三個基因的MPN患者進行Ion Torrent PGM測序,就JAK2、MPL、CALR三個基因而言,3例CALR基因

14、52bp缺失均未被Ion Torrent PGM測序檢出,其余測序結(jié)果與Sanger測序結(jié)果完全吻合。Ion Torrent PGM測序結(jié)果可以顯示基因位置、突變類型、氨基酸的改變和測序深度,最重要的是Ion Torrent PGM測序能顯示突變所占的比例,從而對腫瘤細胞負荷進行定量。
  2)10例三陰性MPN患者Ion Torrent PGM測序結(jié)果顯示:1例ET患者未檢測出基因突變,其余9例患者均檢測到突變,突變個數(shù)為1-3

15、個。其中最常見的為表觀遺傳修飾基因TET2突變,4例患者檢測出TET2基因突變。1例慢性中性粒細胞白血病病人檢測出CSF3RT618I突變。1例PMF患者檢測出TP53基因突變。除此之外,突變還涉及剪接體基因、信號傳導相關基因等。
  結(jié)論:
  1、本研究結(jié)合自已定制的MPN多重PCR引物試劑盒和Ion Torrent PGM測序平臺,成功的建立了一套靈敏特異、快速、高通量的MPN致病相關基因突變檢測方法。Ion Torr

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論