Zmp1的克隆表達(dá)及其對巨噬細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建分枝桿菌鋅離子依賴的金屬蛋白酶1(zmp1)基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，對Zmp1重組融合蛋白進(jìn)行純化；構(gòu)建分枝桿菌zmp1基因與增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)融合的真核表達(dá)載體，驗證其在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)；探討Zmp1蛋白對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及吞噬體-溶酶體融合的影響。
　　方法：
　　1.以卡介苗（BCG）基因組DNA為模板，采用PCR法

2、擴(kuò)增zmp1基因；定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)的多克隆位點中，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-32a(+)-zmp1；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲取Zmp1重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定。
　　2.以BCG基因組DNA為模板，采用PCR法擴(kuò)增zmp1基因；定向克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1的多克隆位點中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-zmp1

3、，并轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，實時定量PCR(qRT-PCR)檢測zmp1基因mRNA的表達(dá)水平。
　　3.用Zmp1重組蛋白作用RAW264.7細(xì)胞后24h，CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力；作用后48h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡。
　　4.將載體pEGFP-N1-zmp1瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后24h，CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力；轉(zhuǎn)染后48h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡。

4、
　　5.減毒鼠傷寒沙門氏菌(SL7207)感染 RAW264.7細(xì)胞(已轉(zhuǎn)染載體pEGFP-N1-Zmp1或Zmp1重組蛋白作用)，采用沙門氏菌熒光抗體和溶酶體相關(guān)膜蛋白標(biāo)志物熒光抗體雙標(biāo)記，通過熒光顯微鏡觀察Zmp1蛋白阻止吞噬體-溶酶體融合的作用。
　　結(jié)果：
　　1.PCR法擴(kuò)增出zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-32a(+)-zmp1，經(jīng)雙酶切及基因測序鑒定構(gòu)建正確；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌BL

5、21（DE3）中表達(dá)出重組Zmp1融合蛋白，相對分子量約為94kDa，大小與預(yù)期融合蛋白相符；Western blot結(jié)果顯示重組Zmp1融合蛋白可與His標(biāo)簽單克隆抗體特異性結(jié)合。
　　2.PCR法擴(kuò)增出zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-zmp1，經(jīng)雙酶切及基因測序鑒定構(gòu)建正確；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞中觀察到綠色熒光表達(dá)；qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-zmp1的RAW264.7細(xì)胞z

6、mp1的表達(dá)顯著升高。
　　3.采用Zmp1重組蛋白細(xì)胞外作用RAW264.7細(xì)胞，在24～96h觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降；細(xì)胞周期在S期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率均有所增加。
　　4.將載體pEGFP-N1-zmp1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，在48～96h觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降；細(xì)胞周期在S期和G2期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率有所增加。
　　5.Zmp1重組蛋白組和pEGFP-N1-zmp1細(xì)胞轉(zhuǎn)染組，

7、雙熒光融合數(shù)量變化不大，影響吞噬體-溶酶體融合差異不明顯。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了zmp1基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得重組Zmp1融合蛋白表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建了zmp1基因真核表達(dá)載體，并在RAW264.7細(xì)胞中獲得重組Zmp1融合蛋白表達(dá)。
　　3.Zmp1蛋白能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡，影響吞噬體-溶酶體融合效果不明顯，為重組BCG疫苗的開