Annexin-1在氧糖剝奪-復糖復氧引起的小膠質(zhì)細胞活化及遷移中的作用及機制研究.pdf

1、目的：缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)致殘率和致死率較高的疾病，有研究表明ANXA1（膜聯(lián)蛋白1，annexin-1）在腦缺血/再灌注損傷中具有神經(jīng)保護作用，但其作用機制尚待進一步研究。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，在腦缺血/再灌注損傷中被活化而對神經(jīng)元的損傷及修復中具有復雜的功能表現(xiàn)。本文以大鼠海馬腦片及BV-2細胞（膠質(zhì)瘤來源的小膠質(zhì)細胞系）為研究對象，研究ANXA1對腦缺血/再灌注引起的小膠質(zhì)細胞活化及遷移的影響，以探討ANXA1的

2、神經(jīng)保護作用的細胞和分子機制。
　　方法：海馬腦片培養(yǎng)并以氧糖剝奪/復糖復氧（OGD/R）的方法構(gòu)建組織缺血再灌注模型；以NeuN標記海馬神經(jīng)元，OX-42或 Iba1標記小膠質(zhì)細胞，用免疫熒光多重標記技術(shù)檢測ANXA1、甲酰肽受體（FPRs）在神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞上的表達；用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄BV-2細胞的跨細胞膜電流；用Transwell遷移法及劃痕實驗法檢測BV-2細胞的遷移能力；用免疫印跡技術(shù)（Western Blot）檢

3、測磷酸化α-catenin的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1、OGD/R誘導海馬神經(jīng)元高表達ANXA1：免疫熒光顯示ANXA1在海馬腦片CA1、CA3和DG區(qū)均有表達。海馬腦片OGD2h、復糖復氧24h后，ANXA1在CA1、CA3和DG區(qū)表達均有所增加，與對照組相比，CA1區(qū)的ANXA1表達增加具有顯著性差異（p<0.01）。以NeuN標記神經(jīng)元，Iba1標記小膠質(zhì)細胞，免疫熒光多重染色結(jié)果顯示， OGD/R處理后海馬腦片中

4、ANXA1與NeuN共標記細胞數(shù)量增多，與對照組相比，在CA1區(qū)的增加具有統(tǒng)計學差異（p<0.05）；ANXA1與Iba1共標記細胞數(shù)量與對照組相比無統(tǒng)計學差異。結(jié)果提示，OGD/R誘導海馬神經(jīng)元高表達ANXA1。
　　2、OGD/R誘導海馬小膠質(zhì)細胞高表達ANXA1的受體FPRs：免疫熒光顯示FPRs在海馬腦片CA1、CA3和DG區(qū)均有表達；以NeuN標記神經(jīng)元，OX-42標記小膠質(zhì)細胞，免疫熒光多重染色結(jié)果顯示，F(xiàn)PRs與Ne

5、uN共標記細胞數(shù)目稀少， FPRs與OX-42共標記數(shù)目占FPRs陽性細胞數(shù)總量的45.5％以上。海馬腦片OGD2h、復灌24h后，與對照組相比，F(xiàn)PRs在海馬腦片各區(qū)的表達量顯著增加（p<0.01）。免疫熒光多重染色結(jié)果顯示，OGD/R處理后FPRs與OX-42共標記細胞數(shù)量均顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學差異（p<0.01），而FPRs與NeuN共標記細胞數(shù)與對照組相比無顯著性差異。結(jié)果提示， OGD/R誘導海馬小膠質(zhì)細胞高表達ANXA

6、1受體FPRs。
　　3、ANXA1經(jīng)由FPRs受體活化小膠質(zhì)細胞：以Iba1標記活化小膠質(zhì)細胞，免疫熒光顯示，OGD/R處理后海馬腦片CA1區(qū)Iba1免疫陽性細胞數(shù)顯著增加，與對照組相比，其增加具有統(tǒng)計學差異（p<0.01）。在OGD階段予以ANXA1模擬肽Ac2-26（1μM）處理能增加CA1區(qū)Iba1免疫陽性細胞數(shù)量；在此階段予以FPRs受體拮抗劑Boc1（4μM）處理則顯著減少Iba1免疫陽性細胞數(shù)量，與單純OGD/R處理

7、組相比，其減少具有統(tǒng)計學差異（p<0.01）。全細胞膜片鉗記錄的結(jié)果顯示：BV-2細胞在+40 mV及以上跨膜電壓引起的跨膜外向電流能被Ac2-26（3.3μM）處理明顯增強，而在-80 mV~-60 mV跨膜電壓范圍內(nèi)Ac2-26（3.3μM）處理能誘發(fā)跨膜內(nèi)向電流；不同細胞個體的全細胞跨膜電流對Ac2-26（3.3μM）處理的反應(yīng)有差異，全細胞跨膜電流明顯受Ac2-26處理影響的細胞占60%(21/35)。結(jié)果提示，OGD/R誘導小

8、膠質(zhì)細胞活化，ANXA1對小膠質(zhì)細胞的活化有促進作用。
　　4、ANXA1經(jīng)由FPRs促進小膠質(zhì)細胞遷移：用Transwell遷移實驗和劃痕實驗檢驗細胞的遷移能力。Transwell遷移試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Transwell下室加入1.32μM Ac2-26和13.2μM Ac2-26的處理均能顯著提高上室細胞向下室的遷移率，與未加Ac2-26組相比，其遷移率增加具有統(tǒng)計學差異（p<0.05, p<0.01）；ANXA1受體拮抗劑Boc

9、1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低細胞遷移率（p<0.05）；10μM Boc1處理對未加Ac2-26組的細胞遷移率均沒有顯著影響。劃痕試驗發(fā)現(xiàn)， Ac2-26（13.2μM）處理能顯著提高BV-2細胞向劃痕區(qū)的遷移數(shù)量，與對照組相比具有顯著差異性（p<0.01）；Boc1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低細胞遷移數(shù)（p<0.05）；而Boc1（10μM）處理對未加Ac2-26組的細胞遷移數(shù)均無顯著影響。這些結(jié)

10、果提示：未做OGD/R處理時ANXA1能經(jīng)由FPRs誘導小膠質(zhì)細胞遷移。
　　對BV-2細胞進行OGD處理2h、復糖復氧24h，Transwell遷移試驗和劃痕試驗均顯示， OGD/R處理顯著增加BV-2細胞遷移能力，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。與單純OGD/R處理組相比，在OGD/R處理過程中加入Boc-1（10μM）能顯著降低 BV-2細胞遷移能力（p<0.05），而在 OGD/R處理過程中加入 Ac2-26（1

11、.32μM）能進一步增強BV-2細胞遷移能力（p<0.05），而加入Boc-1（10μM）能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的這種作用（p<0.05）。這些結(jié)果提示：OGD/R處理誘導小膠質(zhì)細胞的遷移，而ANXA1在OGD/R處理過程中通過作用FPRs能增強小膠質(zhì)細胞的遷移能力。
　　5、ANXA1通過CK2磷酸化α-catenin介導小膠質(zhì)細胞遷移：Western Blot檢測結(jié)果顯示，Ac2-26（1.32μM）處理BV-2細胞24 h能顯著

12、提高α-catenin（ser-641）磷酸化水平，與對照組相比其增加具有顯著性差異（p<0.05），CK2抑制劑TBB(40μM)能翻轉(zhuǎn)Ac2-26的作用，顯著降低α-catenin磷酸化水平（p<0.05），TBB對未加Ac2-26組的α-catenin磷酸化水平無顯著影響。Transwell遷移試驗顯示，TBB(40μM)能翻轉(zhuǎn)Ac2-26（1.32μM，加于下室）的作用，顯著降低BV-2細胞遷移率（p<0.05）；而 TBB對未

13、加 Ac2-26組的BV-2細胞遷移率無顯著影響。PKC抑制劑(GF109203X，2μM)、Raf抑制劑（TAK632，1μM)以及P38抑制劑（SB202190，0.1μM)處理均不能表現(xiàn) TBB的上述兩種翻轉(zhuǎn)效應(yīng)。結(jié)果提示 ANXA1通過激活CK2磷酸化α-catenin而促進小膠質(zhì)細胞遷移。
　　結(jié)論：OGD/R處理增強海馬腦片神經(jīng)元的ANXA1表達以及海馬腦片小膠質(zhì)細胞的FPRs表達；OGD/R處理能促進海馬腦片 CA1