慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因沉默對(duì)雌二醇作用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)是一種女性生殖系統(tǒng)習(xí)見(jiàn)的惡性腫瘤，近些年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。無(wú)孕激素拮抗的雌二醇長(zhǎng)期刺激與之密切相關(guān)[1]，但雌二醇具體如何調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚無(wú)確切結(jié)論。
　　本課題組前期研究表明，雌二醇能夠通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生成VEGF、bFGF、IL-8等，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[2，3]。為進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，本研究選取PI3K

2、為靶點(diǎn)，利用RNA干擾技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa中的PI3K基因，探究其對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的影響及其潛在作用機(jī)制。并觀察PI3K基因沉默對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的影響，初步探討PI3K基因能否成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的新靶點(diǎn)。
　　本文主要從以下三方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞株
　　目的:本課題組前期發(fā)現(xiàn)雌二醇可以

3、通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8等，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，為明確PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的相關(guān)影響機(jī)制，我們利用RNAi抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中的PI3K基因，并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為探究PI3K基因低表達(dá)對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.設(shè)計(jì)合成4組特異性針對(duì)PI3K基因的siRNA，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載

4、體，感染Ishikawa細(xì)胞。
　　2.利用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)各組對(duì)目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點(diǎn)。
　　3.將選取的最佳靶點(diǎn)進(jìn)行包裝成慢病毒shRNA載體，感染Ishikawa細(xì)胞。
　　4.將感染目的基因的細(xì)胞Ishikawa，經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，采用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)目的基因的抑制效果。
　　結(jié)果:1.RT-PCR和Wester

5、n blot篩選出最佳干擾靶點(diǎn)，siRNA序列為:GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA
　　2.經(jīng)測(cè)序證實(shí)，運(yùn)用特異性針對(duì)PI3K基因的siRNA，成功構(gòu)建了慢病毒shRNA載體，包裝滴度為8×108TU/ml。感染Ishikawa細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡下觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，顯示各組感染效率均在90％以上，病毒感染成功。
　　3.經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后，RT-PCR和Western blot驗(yàn)證干擾效率，獲得

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。
　　結(jié)論:RNA干擾技術(shù)可有效地抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因沉默對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的體外影響
　　目的:利用RNA干擾技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達(dá)，檢測(cè)PI3K基因低表達(dá)后對(duì)雌二醇作用Ishikawa細(xì)胞后相關(guān)基因、蛋白的影響，觀察對(duì)其存活能力、周期、

7、凋亡影響，探究PI3K基因低表達(dá)后對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的影響及其潛在機(jī)制。
　　方法:1.RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雌二醇作用感染前后Ishikawa細(xì)胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　2.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染前后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，分析PI3K基因沉默前后對(duì)Ishikawa細(xì)胞生存率的影響。
　　3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell檢測(cè)感染前后細(xì)胞的體外遷移能力，分

8、析PI3K基因沉默前后對(duì)Ishikawa細(xì)胞的體外遷移能力的影響。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)雌二醇處理后各組細(xì)胞周期及凋亡率的變化，分析PI3K基因沉默后對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　結(jié)果:1.E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞的VEGF、bFGF基因和蛋白較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05);NC組與Ishikawa組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);PI3K組細(xì)胞VEGF、bFGF基因和蛋白的

9、表達(dá)較Ishikawa組相比明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)
　　2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞后，細(xì)胞的倍增時(shí)間較對(duì)照組明顯加快(P＜0.05);NC組的細(xì)胞倍增時(shí)間與Ishikawa組相比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); PI3K組細(xì)胞的倍增時(shí)間較Ishikawa組相比明顯延長(zhǎng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.遷移實(shí)驗(yàn)顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞后，穿

10、過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）;PI3K組細(xì)胞穿過(guò)微孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)比Ishikawa組明顯減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，表明PI3K低表達(dá)可以干擾E2上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移的能力。
　　4.細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞后，比對(duì)照組總凋亡率(％)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);NC組的細(xì)胞總凋亡率(％)與Ishikawa組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);PI3K組細(xì)胞比Is

11、hikawa組中晚期凋亡增加，總凋亡率(％)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E2作用于未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞后，比對(duì)照組的G0/G1期比率下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比，各期比例差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);PI3K組細(xì)胞與Ishikawa組相比，G0/G1期增加，S期和G2期減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:PI3K

12、基因低表達(dá)可以干擾E2在基因、蛋白水平激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、bFGF，可以下調(diào)E2對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用和凋亡機(jī)制作用，提示PI3K基因可能成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的潛在靶點(diǎn)。
　　第三部分 構(gòu)建PI3K基因低表達(dá)Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型
　　目的:構(gòu)建PI3K基因低表達(dá)Ishikawa細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，觀察PI3K基因沉默對(duì)子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，進(jìn)一步研究PI3K/Akt信號(hào)通路與子

13、宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性，為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將BALB/C裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。將未轉(zhuǎn)染組(Ishikawa)細(xì)胞、陰性對(duì)照組(NC)細(xì)胞及PI3K基因沉默組(PI3K-shRNA)細(xì)胞分別接種于裸鼠右側(cè)背部。觀察移植瘤成瘤情況及腫瘤生長(zhǎng)情況，成瘤后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)。按照腫瘤體積計(jì)算公式:V=0.5×a×b2來(lái)計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。提取移植瘤組織蛋白質(zhì)，應(yīng)用W

14、estern Blot檢測(cè)各組PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型。Ishikawa組與NC組裸鼠移植體積增長(zhǎng)沒(méi)有明顯差別(p＞0.05);PI3K基因低表達(dá)的PI3K組移植瘤增長(zhǎng)較Ishikawa組明顯減慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ishikawa組、NC組相比，PI3K組裸鼠移植瘤瘤體重量明顯小于其它兩組(p＜0.05），而Ishikawa組與NC組瘤體重量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0

15、.05)。實(shí)驗(yàn)PI3K組移植瘤PI3K蛋白的表達(dá)量較Ishikawa組及NC組顯著降低(P＜0.05)，而Ishikawa組與NC組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)，提示慢病毒介導(dǎo)的PI3K基因RNA干擾載體在體內(nèi)仍能穩(wěn)定遺傳并高效表達(dá)。PI3K組p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)量比Ishikawa組和NC組均顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PI3K基因低表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，提示PI3K基因有可能成為子宮