利拉魯肽降低2型糖尿病非酒精性脂肪肝大鼠肝臟磷酸化JNK的蛋白表達(dá).pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，其主要的病理特征為肝臟脂肪變性，后者可進(jìn)一步發(fā)展為肝炎、肝硬化甚至肝癌。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為與肝臟胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)及“二次打擊”有關(guān)。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase，JNK)信號(hào)通路相關(guān)的炎癥

2、因子參與了NAFLD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)——肝臟IR及“二次打擊”的氧化應(yīng)激肝損傷，與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)作為致炎因子，可誘導(dǎo)JNK信號(hào)通路的活化，進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)的表達(dá)，造成肝臟損傷。利拉魯肽是胰高糖素樣肽（glucagon-likepeptide1，GLP-1）類似物，近年研究證實(shí)，利

3、拉魯肽不僅具有促進(jìn)胰島素分泌、改善胰島素敏感性、保護(hù)胰島β細(xì)胞、降糖等重要作用，還可以改善肝重、減少肝內(nèi)脂肪累積。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)具有胰島素抵抗特點(diǎn)的2型糖尿病大鼠模型，觀察TNF-α、JNK磷酸化、NF-κB與2型糖尿病非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系，探討利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠NAFLD的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:選用健康雄性Wistar大鼠24只;適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后;采

4、用數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC，n=6)和實(shí)驗(yàn)組(EX，n=18)，NC組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)（含20.0％的蔗糖、10.0％的熟豬油、2.5％的膽固醇、1.0％的膽酸、66.5％標(biāo)準(zhǔn)飼料）。喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠隔夜空腹腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，用前以pH4.4的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配成1％的溶液)30mg/kg，NC組僅注射等容積的檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)的第6周，即注射STZ2周后，空腹8h測(cè)尾

5、靜脈血糖，選擇血糖≥7.8mmol/L者為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)（18只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中14只造模成功）。將成模糖尿病大鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為2組:2型糖尿病空白對(duì)照組(DM，n=7)、2型糖尿病+利拉魯肽干預(yù)組(LIR，n=7)。LIR組給予利拉魯肽100μ g·kg-1皮下注射，每日二次，NC組和DM組給予等量的蒸餾水皮下注射，每周測(cè)體重，共干預(yù)治療8周。于實(shí)驗(yàn)第14周末，空腹分別測(cè)量體重、血糖，麻醉后心尖取血、分離血清，檢測(cè)血清中膽固醇(TC)

6、、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、TNF-α、NF-κB水平。蘇木素伊紅(HE)染色觀察肝組織病理變化。油紅O染色觀察肝組織脂肪變性程度。免疫組化法測(cè)定大鼠肝組織JNK、磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表達(dá)水平。JNK主要陽性表達(dá)于肝細(xì)胞漿，少量表達(dá)于肝細(xì)胞核，p-JNK陽性表達(dá)于肝細(xì)胞核。以人工計(jì)數(shù)法半定量肝組織內(nèi)JNK、p-JNK的蛋白表達(dá)水平。
　　應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分

7、析，所有資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以(x)±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，正態(tài)分布且方差齊的資料，用單因素方差分析（ANOVA）法，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，不符合正態(tài)檢驗(yàn)的資料，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)分析用直線相關(guān)分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、各組大鼠一般情況:對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，進(jìn)食量及尿量無明顯變化，體重呈逐漸增加趨勢(shì)。DM組及LIR組

8、大鼠進(jìn)食量、尿量較NC組有所增加。各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NC320.7±12.0g; DM326.3±69.6g; LIR組316.3±34.2g; x2=0.309，P=0.857）。
　　2、實(shí)驗(yàn)6周末血糖數(shù)據(jù)
　　對(duì)照組大鼠空腹血糖為6.50±0.52mmol/L，實(shí)驗(yàn)組為15.90±4.85mmol/L，實(shí)驗(yàn)組血糖較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)
　　3、實(shí)驗(yàn)14周末，三組大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)
　　正

9、常對(duì)照組:FBG6.33±0.69 mmol/L，TC2.18±0.39 mmol/L，TG0.80±0.26 mmol/L, LDL-C1.24±0.47 mmol/L, HDL-C1.55±0.33 mmol/L,ALT19.67±2.16 U/L, AST104.50±11.48 U/L, TNF-α0.83±0.14 ug/ml,NF-κB78.68±12.15μmol/L。
　　糖尿病組:FBG12.99±2.07 mm

10、ol/L，TC4.15±0.41 mmol/L，TG1.83±0.40 mmol/L, LDL-C2.53±0.44 mmol/L, HDL-C0.68±0.23 mmol/L,ALT139.0±20.74 U/L, AST150.00±24.75 U/L, TNF-α1.19±0.16 ug/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L。
　　利拉魯肽組:FBG8.87±1.82 mmol/L，TC3.42±0.82

11、mmol/L，TG1.20±0.30 mmol/L, LDL-C1.86±0.28 mmol/L, HDL-C0.92±0.11 mmol/L,ALT67.14±8.11 U/L,AST164.70±25.49 U/L, TNF-α0.95±0.06 ug/ml,NF-κB116.14±32.63μmol/L。
　　與NC組相比，DM組大鼠血清FBG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、TNF-α、NF-κB水平明顯升高（均P

12、＜0.05），HDL-C水平顯著降低(P＜0.05)。經(jīng)利拉魯肽干預(yù)8周后，LIR組大鼠血清中FBG、TC、TG、LDL-C、ALT、TNF-α、NF-κB均較DM組明顯降低（均P＜0.05），HDL-C及AST較DM組分別有上升和降低的趨勢(shì)，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PHDL-C=0.070;PAST=0.228)。
　　4、各組肝組織病理染色結(jié)果
　　HE染色可見NC組大鼠肝組織中有大小一致的肝細(xì)胞圍繞在肝小葉中央靜脈周圍

13、，呈放射狀整齊排列，肝索結(jié)構(gòu)完整;DM組肝細(xì)胞肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞濁腫、氣球樣變，小葉內(nèi)散在肝細(xì)胞點(diǎn)、灶狀壞死;LIR組肝細(xì)胞氣球樣變、炎癥活動(dòng)程度較DM組明顯改善。油紅O染色可見NC組大鼠肝細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色，無脂滴;DM組大鼠肝組織內(nèi)可見中央靜脈、匯管區(qū)肝細(xì)胞內(nèi)充滿紅色脂滴，肝組織彌漫脂肪變性;LIR組可見肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯減少。
　　5、各組免疫組化結(jié)果
　　3組大鼠間p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平有顯著差別(x2=12

14、.606，P=0.002)。和NC組相比，DM組大鼠肝臟組織p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高（Z=-2.935，P=0.003），經(jīng)利拉魯肽干預(yù)8周后，LIR組肝臟組織p-JNK/JNK蛋白表達(dá)水平較DM組明顯降低（Z=-2.859，P=0.004）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，肝臟組織p-JNK/JNK和血清TNF-α、NF-κB的表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.518，P=0.019;r=0.529，P=0.012)。