成人原代肝細胞的分離、鑒定及其蛋白質合成與P450表達.pdf

1、目的:探討手術切除的成人良性病變肝葉的肝細胞分離及細胞鑒定技術，研究成人原代肝細胞培養(yǎng)過程中的細胞活力的改變，及蛋白質合成與細胞色素P450表達的變化。
　　方法:選擇肝臟良性病變的手術切除肝葉標本，采用改良膠原酶灌注分離法分離肝細胞，用血球計數(shù)板計數(shù)法對分離后的新鮮肝細胞計數(shù)，臺盼藍拒染法檢測新鮮肝細胞活率;利用過碘酸-schiff(PAS)反應來檢測肝細胞的糖原合成能力，并利用免疫組織化學方法來測定肝細胞角蛋白CK18的表達聯(lián)

2、合判斷肝細胞純度;用CCK-8法檢測連續(xù)培養(yǎng)7d肝細胞的細胞活力;全自動生化分析儀檢測成人原代肝細胞在培養(yǎng)過程的白蛋白、尿素合成及相關生化功能指標;應用蛋白質印跡法(Western Blot)檢測體外培養(yǎng)肝細胞細胞色素P450表達（生物轉化反應第一相反應）。
　　結果:
　　1.新鮮分離的成人原代肝細胞數(shù)目大于109個，臺盼藍拒染法檢測肝細胞活率達90％或以上。
　　2.培養(yǎng)24小時后，肝細胞PAS糖原染色發(fā)現(xiàn)成人原代

3、肝細胞內(nèi)糖原被染成紅色顆?；蚱瑺?，抗細胞角蛋白CK-18免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)CK-18在肝細胞內(nèi)均勻分布，被染成棕黃色;糖原染色及細胞角蛋白CK-18聯(lián)合鑒定肝細胞純度達95％以上。
　　3.CCK-8實驗結果顯示肝細胞培養(yǎng)第三天細胞活力處于最佳狀態(tài)。
　　4.培養(yǎng)的1周的過程中，肝細胞均具有良好的合成糖原、白蛋白和尿素的功能。
　　5.培養(yǎng)過程中，ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趨勢，在培養(yǎng)3天時達到最低

4、，培養(yǎng)4天時開始上升，白蛋白的分泌量和尿素合成量在培養(yǎng)3天時達到最高，培養(yǎng)4天時開始下降。
　　6.在離體培養(yǎng)1-7天中，肝細胞在80KD處均可見有細胞色素P450表達，并且在第3天表達最好。
　　結論:
　　1.改良膠原酶灌注分離法分離肝細胞操作步驟簡單，得到的肝細胞數(shù)目多、純度高且具有完善的細胞功能。
　　2.本研究所示肝細胞的細胞活力及細胞的生化性質均在培養(yǎng)的第3天時達到最好的狀態(tài)。
　　3.在離體培