miR-340通過(guò)靶向HMGN5抑制前列腺癌細(xì)胞的致瘤潛力.pdf

1、前列腺癌是一種世界性的常見癌癥，嚴(yán)重威脅男性生活健康。微小RNA(microRNAs)異常表達(dá)廣泛參與腫瘤的發(fā)生，miR-340已被報(bào)道在不同癌癥類型中抑制腫瘤生長(zhǎng)。然而，miR-340是否在前列腺癌中發(fā)揮重要作用目前尚未見報(bào)道。因此本研究的目的是探索miR-340在前列腺癌中的表達(dá)模式和其功能。然后驗(yàn)證miR-340是否通過(guò)其靶基因HMGN5抑制前列腺癌增殖和侵襲，為前列腺癌提供了新的可能的治療靶點(diǎn)。
　　本課題包括以下3部分:

2、第一部分:miR-340在前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)研究。第二部分:miR-340對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。第三部分:miR-340靶基因及其腫瘤抑制機(jī)制初步研究。
　　第一部分 miR-340在前列腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)研究
　　方法:
　　1)收集標(biāo)本，包括20例前列腺癌癌組織與20例配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本。
　　2)使用RPMI1640培養(yǎng)PC-3、22RV-1、DU-145和LNCaP前列腺癌細(xì)胞。RW

3、PE-1正常人前列腺上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　3)采用RT-PCR檢測(cè)前列腺癌癌組織與癌旁組織標(biāo)本中miR-340的表達(dá)水平，以及前列腺癌細(xì)胞系和正常人前列腺上皮細(xì)胞miR-340的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1)與癌旁組織相比，前列腺癌組織中miR-340的表達(dá)明顯下降。
　　2)與正常人前列腺上皮細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞系miR-340的表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論:
　　miR-340在前列腺癌組

4、織和癌細(xì)胞系表達(dá)均顯著下調(diào)。
　　第二部分 miR-340對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　方法:
　　1)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染miR-340 mimics和anti-miR-340至前列腺癌細(xì)胞考察增加或抑制者細(xì)胞中miR-340表達(dá)對(duì)列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　2)采用MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-340過(guò)表達(dá)及抑制miR-340表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響。
　　3)采用TUNEL方法檢測(cè)

5、miR-340過(guò)表達(dá)及抑制miR-340表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　4)采用western blot檢測(cè)miR-340過(guò)表達(dá)及抑制miR-340表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)水平的影響。
　　5)應(yīng)用基于Transwell小室的侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-340過(guò)表達(dá)及抑制miR-340表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1)miR-340過(guò)表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，抑制

6、其表達(dá)可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞增殖。
　　2)miR-340過(guò)表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞克隆形成，抑制其表達(dá)可以增加前列腺癌細(xì)胞克隆形成。
　　3)miR-340過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡，沉默miR-340表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞凋亡。
　　4)miR-340過(guò)表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲，沉默miR-340表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲。
　　結(jié)論:
　　在前列腺癌細(xì)胞中miR-340過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制前列

7、腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制其侵襲能力。
　　第三部分 miR-340靶基因及其腫瘤抑制機(jī)制的初步研究
　　方法:
　　1)構(gòu)建含有野生型和突變型HGMN53'UTR的miR-340結(jié)合元件的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，與miR-340 mimics或anti-miR-340共轉(zhuǎn)染至DU-145細(xì)胞考察HMGN5是否是miR-340的直接靶基因。
　　2)采用熒光定量PCR檢測(cè)miR-340 mimics或anti-mi

8、R-340對(duì)HMGN5mRNA表達(dá)的影響。
　　3)采用Western blot檢測(cè)miR-340 mimics或anti-miR-340對(duì)HMGN5蛋白以及Bcl-2，cyclin B1和MMP9蛋白表達(dá)的影響。
　　4)共轉(zhuǎn)染HMGN5和miR-340 mimics考察HMGN5過(guò)表達(dá)對(duì)miR-340mimics誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　5)Spearman分析前列腺癌組織中HMGN5 mRNA的表

9、達(dá)與miR-340表達(dá)水平相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1) miR-340可直接靶向HMGN5基因。
　　2) miR-340過(guò)表達(dá)明顯降低前列腺癌細(xì)胞HGMN5 mRNA及蛋白的表達(dá)。相反，抑制miR-340能明顯增加HGMN5 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　3)miR-340過(guò)度表達(dá)明顯抑制前列腺癌細(xì)胞Bcl-2、cyclin B1和MMP9蛋白的表達(dá)。相反，沉默miR-340可增加這些蛋白表達(dá)。
　　4)m

10、iR-340過(guò)表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用可以被HMGN5過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。
　　5)前列腺癌組織中HMGN5 mRNA的表達(dá)與miR-340得表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　確定HMGN5為前列腺癌細(xì)胞miR-340的直接靶基因，miR-340過(guò)表達(dá)通過(guò)負(fù)調(diào)控HMGN5抑制前列腺癌細(xì)胞致腫瘤潛力。我們首次報(bào)道了miR-340在前列腺癌中的關(guān)鍵作用以及miR-340和HMGN5的直接關(guān)系。因此，本研究不僅提