pIDO在人NK細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞殺傷機(jī)制中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代生物工程技術(shù)以pIDO基因?yàn)檠芯磕繕?biāo)，探討pIDO基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及該基因在NK細(xì)胞對(duì)豬內(nèi)皮細(xì)胞殺傷中的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：首先運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)獲取并分析pIDO基因5′調(diào)控區(qū)，預(yù)測(cè)可能存在的調(diào)控位點(diǎn)。構(gòu)建7個(gè)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子缺失片段和含有熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，分別將其轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定pIDO基因的關(guān)鍵調(diào)控序列。

2、人工合成pIDO的cDNA序列，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro-IDO，并將其轉(zhuǎn)染至豬內(nèi)皮細(xì)胞系構(gòu)建高表達(dá)pIDO基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系與NK92細(xì)胞混合培養(yǎng)，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法對(duì)NK細(xì)胞殺傷穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的能力進(jìn)行評(píng)估。運(yùn)用ELISA法和real-time PCR方法檢測(cè)NK92細(xì)胞的IFN-γ和LFA-1表達(dá)強(qiáng)度，評(píng)估NK92細(xì)胞的活化水平。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)分析顯示p

3、IDO基因啟動(dòng)子區(qū)含有57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)用雙酶切和DNA測(cè)序的方法對(duì)構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，缺失突變體熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功。運(yùn)用熒光檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)pIDO基因5′調(diào)控區(qū)存在多處調(diào)控區(qū)域，其中轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1035~-903bp和-481~-378bp區(qū)域的缺失對(duì)熒光素酶活性的影響最明顯。成功構(gòu)建高表達(dá)pIDO基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)豬內(nèi)皮細(xì)胞系（PED-IDO）。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系可以抵御NK92細(xì)胞的殺傷作用，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，將NK92細(xì)胞