Junctophilin2對SK2通道表面膜表達的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　小電導Ca2+激活K+通道（Small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel）是通過細胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道，表達在幾乎所有可興奮細胞。SK2通道是哺乳動物細胞中一種非電壓依賴性鉀通道，對細胞內(nèi) Ca2+濃度的改變具有很強的親合性，當胞漿中的Ca2+濃度升高時，通過 Ca2+與鈣調(diào)蛋白連接誘導構(gòu)象改變，S K通道激活，K+外流

2、，參與心肌細胞動作電位復極化過程，尤其發(fā)生于動作電位復極晚期，此期相當于心肌細胞興奮性的相對不應期和超常期，而臨床發(fā)生的心律失常多見于這一時期。因此 SK2通道對動作電位時程和構(gòu)成起關鍵作用。SK2通道表達異?？梢鹦募」δ艿淖兓?，可能是導致或者誘發(fā)房顫、心房撲動等心律失常的機制之一，因此研究 SK2通道分子調(diào)控具有十分重要的意義。
　　耦聯(lián)膜復合體（junctional membrane complexs,JMCs）位于細胞膜（

3、PM）表面與內(nèi)（?。┵|(zhì)網(wǎng)（SR/ER）之間，是實現(xiàn)可興奮細胞有效功能交通的結(jié)構(gòu)基礎。Junctophilins（JPs，JPHs）是近年來發(fā)現(xiàn)的參與形成耦聯(lián)膜復合體重要蛋白分子，其包含有JMC特性，通過使細胞膜與內(nèi)（?。┵|(zhì)網(wǎng)膜之間保持較固定的距離而使JMC穩(wěn)定。Junctophilin2位于心肌細胞偶聯(lián)膜復合體中，是一種膜結(jié)合蛋白，它同時作用于細胞膜和內(nèi)（肌）質(zhì)網(wǎng)膜，使兩者達到相當近距離，可維持 Ca2+穩(wěn)態(tài)，實現(xiàn)心肌細胞鈣誘導鈣釋放過

4、程（calcium-induced calcium release,CICR），在心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)正常運轉(zhuǎn)過程中起到至關重要的作用。在肥厚性心肌病和心力衰竭等心臟疾病中顯示有JPH2蛋白表達水平的下調(diào)，可引起心肌細胞鈣致鈣釋放過程減弱，興奮-收縮失耦聯(lián)。已有研究闡明Junctophilin與膜表面離子通道耦聯(lián)具有重要意義，其表達異常成為相關疾病發(fā)生的病理機制之一。
　　本實驗室之前的研究證實通過腺病毒介導的靶向小鼠JPH2基

5、因的siRNA，可沉默小鼠心肌細胞JPH2蛋白的表達，有意義的是也可抑制細胞膜SK2通道的表達。為進一步研究JPH2蛋白與SK2通道的相互作用，本研究通過體外實驗，建立HEK293細胞SK2通道表達細胞株、SK2通道和JPH2蛋白共表達細胞株及SK2通道和JPH2突變蛋白共表達細胞株，采用細胞直接裂解法和細胞表面生物素標記法，通過Western blot和細胞免疫熒光化學技術檢測JPH2蛋白對SK2通道表達的影響，為探討SK2通道與JP

6、H2蛋白相互作用的分子機理奠定基礎。
　　材料方法：
　　1.實驗中分別構(gòu)建pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變的重組質(zhì)粒。
　　2.培養(yǎng)HEK293細胞并傳代，參照脂質(zhì)體Lip2000操作步驟，分別將構(gòu)建的pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+

7、141突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，約48h后用熒光顯微鏡觀察各質(zhì)粒中綠色熒光蛋白EGFP的表達。
　　3.采用細胞直接裂解法和細胞表面生物素標記方法分別提取轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒48h后HEK293細胞的總蛋白和膜蛋白,通過Western blot檢測SK2通道的表達水平；Western blot結(jié)果用Imag

8、eJ軟件做灰度分析后，數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計學處理，用GraphPad Prism5進行統(tǒng)計分析學處理，不同組間SK2通道總蛋白和膜蛋白表達差異比較均采用兩樣本均數(shù)的t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。
　　4.通過細胞免疫化學和熒光顯微鏡觀察分別轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒48h后SK2通道在HEK293細胞上的定位與亞細胞分

9、布。
　　結(jié)果：
　　1.通過酶切和測序鑒定pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，采用細胞直接裂解法提取HEK293細胞總蛋白，細胞表面生物素標記方法提取 HEK293細胞膜蛋白。轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2質(zhì)粒的HEK293細胞與轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-

10、EGFP質(zhì)粒的HEK293細胞相比，SK2通道總蛋白與膜蛋白表達量均有顯著增加；而轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突變質(zhì)粒的HEK293細胞與轉(zhuǎn)染pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒的HEK293細胞相比，SK2通道的總蛋白與膜蛋白表達量均顯著減少。
　　3.細胞免疫化學結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP質(zhì)粒的HEK293細胞，其SK2通道主要分布于胞膜及胞質(zhì)中；轉(zhuǎn)染 pSK2-IRES-EGFP+