骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞片-基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1用于骨修復(fù)的研究.pdf

1、背景：
　　在臨床中，因?yàn)橥鈧仍蛟斐晒钦鄢３Ｐ枰中g(shù)治療，當(dāng)骨折部位血供差，或者有大片骨缺損時(shí)，骨折愈合效果往往一般。目前，自體骨移植仍被認(rèn)為是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，自體供骨來(lái)源有限，供體部位易產(chǎn)生并發(fā)癥，患者術(shù)后手術(shù)部位疼痛，特別是需二次手術(shù)是，取材更加困難，等等這些原因限制了此技術(shù)的應(yīng)用。異體骨的移植則存在免疫排斥的問(wèn)題。近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，組織工程技術(shù)，或許可以提供一條解決途徑。組織工程包含三個(gè)要素:種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子

2、、生物材料支架。干細(xì)胞具有全能性，可以分化成多種組織，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲取方便，易于擴(kuò)增是種子細(xì)胞的良好選擇。另外，由干細(xì)胞形成的細(xì)胞片，解決了傳統(tǒng)組織材料存在的降解速率、炎癥刺激等不利于組織生長(zhǎng)的問(wèn)題，可作為修復(fù)骨組織的理想方法。SDF-1α作為一種趨化因子，在組織損傷區(qū)域高表達(dá)，募集體內(nèi)的干細(xì)胞到達(dá)損傷區(qū)域，參與修復(fù)過(guò)程，且已有多項(xiàng)研究證明，SDF-1α可促進(jìn)干細(xì)胞的骨向分化，可以作為組織工程的生長(zhǎng)因子。因此在本課題中，我們將研究

3、SDF-1α對(duì)干細(xì)胞的影響以及干細(xì)胞片結(jié)合SDF-1α在骨修復(fù)的應(yīng)用，探討其臨床應(yīng)用前景。本課題主要研究以下兩個(gè)方面:(1) SDF-1α對(duì)大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞片的增殖、分化的作用，以及其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用;(2)間充質(zhì)干細(xì)胞片移植結(jié)合局部注射SDF-1α修復(fù)骨折的研究。
　　第一部分 SDF-1α對(duì)大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞片的增殖、分化的作用，以及其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用
　　目的：
　　

4、研究SDF-1α對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化的影響，以及其對(duì)干細(xì)胞片的影響，同時(shí)比較不同濃度的SDF-1α對(duì)干細(xì)胞的趨化作用。
　　方法：
　　用不同濃度的SDF-1α與MSCs一同培養(yǎng)1、3、7天后，使用CCK8檢測(cè)各種濃度的SDF-1α對(duì)MSCs的增殖影響，在CCK8實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用0 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200 ng/mL濃度的SDF-1與MSCs共培養(yǎng)，3和7天后檢測(cè)BMP-2，ALP, OCN

5、，VEGF和CXCR4等基因表達(dá)情況;制備MSCs細(xì)胞片，100ng/mL的SDF-1與MSCs細(xì)胞片共培養(yǎng)7天、14天后，檢測(cè)BMP-2，ALP, VEGF，OCN和CXCR4等基因表達(dá)情況，另設(shè)空白的對(duì)照組。利用Transwell檢測(cè)SDF-1對(duì)干細(xì)胞的趨化作用，并設(shè)不同濃度的SDF-1觀察其發(fā)揮作用的最佳濃度。
　　結(jié)果：
　　10ng/mL以上的SDF-1α對(duì)MSCs的增殖有促進(jìn)作用，且與時(shí)間和濃度呈正比，與對(duì)照組相

6、比，經(jīng)SDF-1α誘導(dǎo)的MSCs和MSCs細(xì)胞片，都能高表達(dá)BMP-2，ALP,OCN，VEGF。CXCR4在誘導(dǎo)后的MSCs的表達(dá)中增高，而在誘導(dǎo)后的MSCs細(xì)胞片中低表達(dá)。Transwell實(shí)驗(yàn)中可以明顯觀察到干細(xì)胞隨著濃度高的SDF-1方向遷移，當(dāng)SDF-1濃度為100 ng/mL時(shí)，其效果最佳。
　　結(jié)論：
　　SDF-1對(duì)MSCs具有趨化作用，且SDF-1可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞和BMSC細(xì)胞片的成骨分化，也能刺激血管

7、生成，為我們進(jìn)一步研究如何利用SDF-1/CXCR4信號(hào)軸結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞片于組織工程修復(fù)骨缺損奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　第二部分 MSC細(xì)胞片/SDF-1α修復(fù)大鼠脛骨骨折的研究
　　目的：
　　研究將MSCs細(xì)胞片移植到大鼠的脛骨骨折模型并結(jié)合局部注射SDF-1α的方法，觀察其修復(fù)效果。
　　方法：
　　將分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs培養(yǎng)成MSC細(xì)胞片，然后與SDF-1α共培養(yǎng)7天后，刮取下細(xì)胞片移植至骨折模

8、型。32只大鼠，制造脛骨中上1/3骨折模型，并用型號(hào)為21G的注射器針頭行髓內(nèi)固定，實(shí)驗(yàn)分四組，組1為空白對(duì)照;組2在術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后一周在骨折處注射100ng/mL的SDF-1α溶液;組3為在骨折處移植經(jīng)SDF-1α誘導(dǎo)后的MSC細(xì)胞片，并使細(xì)胞片包繞骨折部位;組4為在骨折處移植MSCs細(xì)胞片，并在術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后一周注射100ng/mL的SDF-1α。術(shù)后2周采取新生組織檢測(cè)ALP、OCN、OPG、VEGF的表達(dá)情況，術(shù)后4、8周的標(biāo)本

9、行X線檢查及組織學(xué)檢查，并對(duì)X線結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，術(shù)后8周進(jìn)行micro-CT和免疫組化分析。
　　結(jié)果：
　　組4術(shù)后2周的新生組織高表達(dá)了骨向分化基因ALP、OCN、OPG及血管生成因子(VEGF)，術(shù)后4、8周組4的X線評(píng)分顯著高于對(duì)照組，組織學(xué)、免疫組化和micro-CT顯示，組4的骨折線附近有大量新生骨痂形成，多于同時(shí)期其他組，并在8周達(dá)到完全的骨性連接。而對(duì)照組組1，纖維組織仍填充骨折處，形成骨不連。
　　結(jié)論