用于膀胱過度活動癥治療的天然草藥活性成分尼古丁靶點研究.pdf

1、背景和目的：
　　膀胱多度活動癥（overactive bladder，OAB），是臨床上常見以尿急癥狀為特征的癥候群，常伴尿頻、夜尿，可伴或不伴急迫性尿失禁。正常排尿需要神經(jīng)系統(tǒng)、膀胱和括約肌機(jī)制的協(xié)調(diào)。OAB致病機(jī)制的包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)等不同水平及膀胱平滑肌本身的抑制失控和異常興奮。有研究顯示，全世界約有10.7％的人（4.55億）患有OAB，歐美國家的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，OAB的發(fā)病率隨著年齡的增長而急劇增加，40-44歲

2、年齡組男性病率為3%，女性為9%，75以上歲年齡組的男性發(fā)病率為42%，女性為31%?？梢哉f，OAB是一常見的功能障礙，雖然并不致命但在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，包括生理、心理、社會及性生活方面的問題，此外，還使患者承受較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　藥物治療是OAB治療的基礎(chǔ)，抗膽堿能藥物是目前臨床治療OAB的一線藥物，該類藥物通過選擇性阻滯介導(dǎo)膀胱逼尿肌收縮的乙酰膽堿（Acetylcholine，ACh）與乙酰膽堿受體結(jié)合，抑

3、制逼尿肌不自主收縮，改善膀胱功能。乙酰膽堿受體包括兩類，毒蕈堿型乙酰膽堿受體（muscarinicacetylcholine receptors，M受體）和煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors. N受體）。無論是M受體還是 N受體在氨基酸組合及結(jié)構(gòu)上都有一些共同特征。目前有研究證實，經(jīng)典M受體阻滯劑阿托品、毒扁豆堿亦可作用于N受體。同時，N受體表達(dá)于尿道上皮與膀胱傳入神經(jīng)中，參與了逼尿肌

4、的收縮作用，與OAB的發(fā)生相關(guān)，因此，N受體阻滯劑因此也成為了治療OAB的潛在藥物。研發(fā)人員將N受體阻滯劑左旋美加明氫氯化合物Dexmecamylamine應(yīng)用于OAB的治療，近期完成了Dexmecamylamine的Ⅱ期臨床試驗。另一方面，索利那新作為一種臨床上目前常用的治療OAB新型抗膽堿藥，具備 M3受體高度選擇性的特性，目前在臨床觀察中證明，索利那新在治療OAB的過程中未發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能損害及心血管不良反應(yīng)，臨床耐受性良好。同時有報

5、道稱已發(fā)生對托特羅定（tolterodine）不敏感的OAB患者，改服用索利那新取得滿意的療效。是否存在索利那新類似阿托品，通過阻滯N受體治療OAB的可能？為此，本課題組擬以基因工程獲得的具有表達(dá)多種N受體作為蛋白質(zhì)靶標(biāo)分子的非洲爪蟾卵母細(xì)胞（Xenopus Oocytes）模型，在分子水平上對索利那新進(jìn)行靶向測定，分析確定其對N受體的作用。
　　中藥、植物藥是醫(yī)藥的重要組成部分，其活性物質(zhì)的分離和提純是藥物先導(dǎo)化合物和新藥開發(fā)的

6、重要途徑，如紫杉醇、青蒿素、麻黃堿等藥物就是來源于天然產(chǎn)物。本實驗擬通過利用小白鼠進(jìn)行生物活性跟蹤，結(jié)合天然產(chǎn)物的色譜分離和結(jié)構(gòu)鑒定，生物靶點作用研究，以期發(fā)現(xiàn)新穎的、作用于 N受體的天然有機(jī)小分子化合物。這類化合物的發(fā)現(xiàn)為研發(fā)用于治療OAB的新藥起了一個重要的開端。
　　菊科(Copositae)苦荬菜屬(Ixeris genus)植物抱莖苦荬菜（Ixeris sonchifolia hance）,別名為苦碟子，屬多年生草本植物

7、，中醫(yī)認(rèn)為其具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎等作用。藥理研究表明，苦碟子可能具備保肝、抗氧化、抗煙堿、抗病毒等作用?？嗟尤轂樵现瞥傻闹兴幾⑸湟骸暗}靈注射液”，目前在臨床上用于治療心血管疾病藥物。分離提取苦碟子的有效成分及對這些成分進(jìn)行藥理活性研究是目前研究熱點，主要分離成分包括腺苷、倍半萜內(nèi)酯類和黃酮類化合物。本實驗利用色譜柱法分離苦碟子有效成分，通MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC和DEPT等方法對分離出的2個化合物單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行

8、鑒定。來探索苦碟子中具有抗尼古丁活性成分的情況，期望獲得治療OAB的抗膽堿能藥物的先導(dǎo)化合物。
　　第一部分：索利那新尼古丁受體作用研究
　　材料和方法
　　1.選擇至少半年未取過卵母細(xì)胞的雌性成年爪蟾，手術(shù)取出成熟的爪蟾卵母細(xì)胞，移入含有慶大霉素的巴士緩沖液。
　　2.琥珀酸索利那新片ND96溶液溶解，抽濾，稀釋制成摩爾濃度為1mM的索利那新標(biāo)準(zhǔn)液備用。
　　3.使用質(zhì)粒中量提取試劑盒分別提取含有α3、β

9、4、α4、β2和α7亞基的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，使用RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒對酶切后的線性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，使用轉(zhuǎn)錄清潔試劑盒分別對cRNA進(jìn)行純化，最后測定OD值。
　　4.使用顯微注射器對爪蟾細(xì)胞進(jìn)行注射，每個爪蟾細(xì)胞注入13-50 nL水溶液、10-40 nG cRNA。
　　5.使用自動并聯(lián)電壓鉗電生理記錄系統(tǒng)記錄N受體爪蟾細(xì)胞表達(dá)模型的乙酰膽堿門控作用電流。
　　6.實驗數(shù)據(jù)分析和制表軟件采用Prism5 Gr

10、aphpad，擬合劑量反應(yīng)方程I=Imax/[1+(X/IC50)nH],其中，I為受體激動劑（乙酰膽堿）濃度（X）的電流響應(yīng)，Imax為最大電流，IC50為實驗藥物（索利那新）的半效抑制濃度，nH為希爾系數(shù)。經(jīng)過計算可得索利那新的半效抑制濃度及量效關(guān)系曲線。
　　結(jié)果
　　1.在N受體亞基（α4β2,α3β4和α7）爪蟾卵母細(xì)胞模型上，索利那新可有效阻滯乙酰膽堿引起的內(nèi)向電流，給予100μM索利那新可使內(nèi)向電流減少80%~

11、95%，其中α3β4亞基內(nèi)向電流減少尤其明顯。在沖洗3分鐘后，再次給予乙酰膽堿，內(nèi)向電流可恢復(fù)，為可逆性抑制作用。
　　2.索利那新可高度選擇性競爭抑制乙酰膽堿與α3β4受體相結(jié)合，其 IC50值為409±51 nM，而α4β2與α7受體上索利那新的IC50值分別為5.5±1.1μM、8.4±1.0μM，分別是其的13倍與20倍。
　　第二部分：苦碟子抗尼古丁活性成分的提取分離
　　材料和方法
　　1.取干燥的苦

12、碟子粉末22千克，95%的工業(yè)乙醇浸泡，乙醇提取液共濃縮成6L水液濃縮物，依次使用石油醚（petroleum ether，PE）、乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）和正丁醇（n butanol）進(jìn)行萃取，得石油醚萃取物303克，乙酸乙酯萃取物49克和正丁醇萃取物131克。
　　2.將303克的石油醚（PE）萃取物用適量的乙酸乙酯溶解，稱取400g硅膠（200-300目）倒入研缽內(nèi)，然后將溶解好的PE層萃取物倒入研缽內(nèi)并與

13、硅膠拌勻，在通風(fēng)櫥中揮發(fā)溶劑至干，將拌過硅膠的樣品研磨均勻，作為上柱樣品。經(jīng)TLC檢測后選擇石油醚-乙酸乙酯體系為合適的洗脫劑，石油醚作為溶劑濕法裝柱。稱取1500g硅膠作為柱層析硅膠，用石油醚拌為糊狀，玻璃棒攪拌趕出氣泡，然后倒入內(nèi)徑為17cm的玻璃柱中，濕法裝柱，沖實后上樣，依次用PE：EA混合洗脫劑20:1、15:1、10:1、4:1、2:1、1:1、乙酸乙酯、甲醇梯度洗脫，用250ml錐形瓶收集餾分，TLC法檢測追蹤成分，1%香

14、草醛濃硫酸的乙醇溶液為顯影劑，110℃下加熱顯色，以硅板上斑點顏色位置來跟蹤檢測，合并相同斑點的收集餾分。共得到10個成分，A1~A10。
　　3.將49g乙酸乙酯（EA）萃取物用適量的乙醇溶解，裝柱方法與石油醚萃取物裝柱方法相同。稱取200g硅膠拌樣曬干，稱取硅膠1000g，用二氯甲烷調(diào)成糊狀，倒入內(nèi)徑為13cm的玻璃柱中，濕法裝柱，沖實后上樣，依次用二氯甲醇，二氯甲醇：甲醇混合洗脫劑40:1、30:1、15:1、10:1、8:

15、1、5:1、2:1，甲醇梯度洗脫。共得到8個成分，F(xiàn)1~F8。
　　結(jié)果
　　1.本實驗先后給予小白鼠苦碟子分離成分及尼古丁溶液灌胃，先給予樣品去離子水溶液灌胃，20分鐘給予致死劑量的尼古丁溶液灌胃，觀察小白鼠的抖動、癱瘓、死亡等尼古丁毒性情況，如小白鼠未表現(xiàn)出尼古丁中毒癥狀，則推測所給予的苦碟子成分可能具備抗尼古丁活性。
　　2.通過有機(jī)溶劑萃取、柱層析及高壓液相色譜等分離方法，利用薄層色譜法鑒別、跟蹤分離成分，從苦

16、碟子全草分離得到抗尼古丁活性成分，特別是乙酸乙酯萃取物中的F2-4-2具有顯著的抗尼古丁活性。對F2-4-2進(jìn)一步利用高壓液相色譜分離的得到2個單體化合物F2-4-2a和F2-4-2b，有望成為新型治療OAB藥物的先導(dǎo)化合物。
　　第三部分：苦碟子抗尼古丁單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定
　　材料和方法
　　1.樣品（F2-4-2a和F2-4-2b）經(jīng)HPLC分離后，減壓旋蒸掉流動相溶劑，分別用氘代氯仿溶解，進(jìn)行核磁測定。
　

17、　2.通過MS（質(zhì)譜）、1H-NMR（核磁共振氫譜）、13C-NMR（核磁共振碳譜）、HSQC（異核單量子關(guān)系譜圖）和DEPT（無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜圖）等方法對分離得到的F2-4-2a、F2-4-2b2個單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　結(jié)果
　　1.得到2個可能具備抗尼古丁活性的新型單體化合物，分別為 F2-4-2a為(R)-(–)-5-Hydroxy-4-(2-hydroxy-propylidene)-5,6,6-trime

18、thyl-cyclohept-2-enone，右旋5-羥基-4-(2-羥基-亞丙基）-5,6,6-三甲基-2-烯環(huán)庚酮；F2-4-2b為(L)-(+)-5-Hydroxy-4-(2-hydroxy-propylidene)-5,6,6-trimethyl-cyclohept-2-enone，左旋5-羥基-4-(2-羥基-亞丙基）-5,6,6-三甲基-2-烯環(huán)庚酮
　　2.2個化合物為首次發(fā)現(xiàn)，其抗尼古丁活性可能與拮抗尼古丁與煙堿受