miR-192靶向TCF7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和侵襲的抑制作用.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤（osteos arco ma）是較常見的惡性骨腫瘤，主要影響兒童和青少年。骨肉瘤具有較強(qiáng)的遷移能力，導(dǎo)致許多患者死于肺轉(zhuǎn)移。雖然人們在骨肉瘤的治療上投入很多精力，但患者五年生存率仍僅達(dá)60％-70%。目前，人們的研究主要集中在后基因組方面，因此，從基因水平上探討骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的診斷和防治方法顯得尤為重要。MicroRNA（miRNA）是一類保守的內(nèi)源性非編碼小RN A，通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平

2、調(diào)控基因的表達(dá)。miRN A參與許多生物過程，如細(xì)胞的增殖、血管生成、細(xì)胞代謝等，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。最新研究報道，miR-192在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，如肺癌、直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而，關(guān)于miR-192對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報道。因此，探討miR-192對人骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，揭示其相關(guān)的作用機(jī)制，將為骨肉瘤的臨床防治提供新的思路和策略
　　研究目的：

3、　　本實(shí)驗(yàn)通過骨肉瘤患者組織標(biāo)本，檢測骨肉瘤組織及其癌旁組織中miR-192及TCF7基因表達(dá)差異。采用骨肉瘤U-2OS和MG63細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染miR-192對骨肉瘤增殖、凋亡及侵襲遷移的影響，并初步探索miR-192的生物靶標(biāo)及其調(diào)控機(jī)制，為miRN A在骨肉瘤的防治的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（2013年6月至2015年3月期間）收集20例骨肉瘤患者癌組織及其癌旁組織標(biāo)本，-8

4、0℃保存。使用熒光實(shí)時定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）方法檢測20例骨肉瘤組織及其癌旁組織標(biāo)本中miR-192及TCF7基因 mRNA的表達(dá)水平，并分析二者之間的關(guān)系。同時采用免疫印跡法（Western blot）檢測TCF7蛋白的表達(dá)水平。
　　2.采用RT-qPCR方法檢測成骨細(xì)胞hFOB1.19，骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中miR-192及TCF7基因的mRN A表達(dá)水平

5、。
　　3.合成miR-192 agomir和miR-192 negative control，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其分別轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中。實(shí)驗(yàn)分組如下：
　?、賛iR-192組：轉(zhuǎn)染miR-192 a go mir。
　?、贜C組：轉(zhuǎn)染miR-192 negative control。
　?、跙lank組：僅轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體。
　　4.CCK-8法檢測細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)，觀察mi

6、R-192對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)和Caspase酶活性實(shí)驗(yàn)，觀察miR-192對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察miR-192對骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響。
　　7.Tra nswe ll實(shí)驗(yàn)，觀察miR-192對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　8.采用PicTar、miRwalk、TargetScan和miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-192的作用靶標(biāo)。同時構(gòu)

7、建含有TCF7的3’-UTR區(qū)的野生型和突變型的重組雙熒光素酶報告基因載體，分別將其與miR-192 agomir或miR-192 negative control一起共轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中，并運(yùn)用Western blot實(shí)驗(yàn)方法和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)證實(shí)TCF7是miR-192的作用靶標(biāo)。
　　9.Western blot檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-192 agomir后，骨肉瘤細(xì)胞U-2OS及MG63中細(xì)胞周期蛋白

8、CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin和與侵襲遷移相關(guān)的蛋白Sna il的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與癌旁組織相比，骨肉瘤組織中，miR-192的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，TCF7 mRNA的水平明顯升高(P<0.01)，并且miR-192的表達(dá)與TCF7 mRNA的水平呈負(fù)相關(guān)。此外，骨肉瘤組織中TCF7的蛋白表達(dá)也高于癌旁組織。
　　2.骨肉瘤細(xì)胞U-2OS和MG63中，miR-192的表達(dá)明顯低于成

9、骨細(xì)胞hFOB1.19(P<0.01)，TCF7 mRNA表達(dá)明顯高于成骨細(xì)胞hFOB1.19(P<0.01)。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-192 ago mir后，miR-192轉(zhuǎn)染組的miR-192表達(dá)水平顯著高于NC組和Blank組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-192后，骨肉瘤細(xì)胞的miR-192表達(dá)水平明顯上調(diào)。
　　4.CCK-8（Cell Counting Kit）生長實(shí)驗(yàn)和集落形成

10、結(jié)果顯示，與NC組和Blank組比較，miR-192組的骨肉瘤細(xì)胞在OD450處的吸光度值明顯下降，集落形成數(shù)目也明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細(xì)胞的吸光度和集落形成數(shù)目無顯著性差異(P>0.05)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和Caspase-3酶活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組和Blank組比較，miR-192組骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明顯升高，

11、其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而NC組和Blank組間比較骨肉瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)和Caspase-3活性無顯著性差異(P>0.05)。
　　6.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組和Blank組相比較，miR-192組的骨肉瘤細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而 NC組和Blank組間比較穿過基底膜的骨肉瘤細(xì)胞數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。
　　7.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與NC組和B

12、lank組比較，miR-192組細(xì)胞的遷移能力明顯降低，而N C組和Bla nk組間比較細(xì)胞的遷移能力無顯著性差異。
　　8. Western blot和雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TCF7是miR-192的作用靶標(biāo)。
　　9.Western blot結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染miR-192 agomir后，與NC組和Blank組比較，miR-192組中，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1，凋亡抑制蛋白Survivin與侵襲遷移相關(guān)的蛋白Sn

13、ail的表達(dá)均下降，而NC組與Blank組比較，細(xì)胞中CyclinD1，Survivin和Snail蛋白的表達(dá)無差異。
　　結(jié)論：
　　1.骨肉瘤組織和細(xì)胞中，miR-192異常低表達(dá)，TCF7高表達(dá)，二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　2.miR-192通過作用于TCF7的3’-UTR區(qū)負(fù)向調(diào)控其表達(dá)，并抑制其下游相關(guān)基因CyclinD1，Survivin和Snail的表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　3.上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中mi