巨噬細(xì)胞通過物理粘附和機(jī)械牽引作用修復(fù)腦血管損傷.pdf

1、出血性腦中風(fēng)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的一類疾病，腦出血后會造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。近年來隨著腦成像技術(shù)的進(jìn)步，原來不能檢測到的腦微出血的現(xiàn)象也越來越受到重視。腦微出血是腦部微小血管病變后產(chǎn)生的出血現(xiàn)象。內(nèi)皮層的損傷是血管破裂的主要原因。因此快速修復(fù)內(nèi)皮層損傷對保持腦血管健康是很重要的。但是腦出血后損傷的血管是怎么修復(fù)的？由于缺少合適的動物模型，這個問題還沒有被回答。
　　為了解決這個問題，建立合適的腦出血動物模型是非常必要的。斑馬魚具

2、有身體透明和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，非常適合進(jìn)行實(shí)時觀測和分子機(jī)制的研究。我們在斑馬魚中構(gòu)建了一個新的腦出血模型。我們用雙光子激光特異的損傷腦血管單個內(nèi)皮細(xì)胞，這樣可以引起血管的破裂和腦出血。利用這個方法，選擇不同大小或者不同血流的血管就可以很好的模擬腦出血和腦微出血。
　　巨噬細(xì)胞與腦損傷、腦出血、以及血管發(fā)育和血管重塑等密切相關(guān)，但巨噬細(xì)胞是否在腦血管損傷修復(fù)中起作用還不清楚。為了研究腦出血巨噬細(xì)胞在血管修復(fù)方面的功能，我們利用標(biāo)記巨

3、噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因系觀察腦出血后巨噬細(xì)胞的行為。我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞會在血管損傷后三十分鐘左右被招募到血管損傷的位置。而后巨噬細(xì)胞伸出偽足粘附損傷傷口的內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞會在隨后的3個小時左右回縮偽足并牽拉內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞會被拉出形同偽足的突出，最后巨噬細(xì)胞會介導(dǎo)血管的兩個斷口連接。巨噬細(xì)胞只有在血管損傷修復(fù)完成后才會離開。
　　損傷血管通過什么趨化因子招募巨噬細(xì)胞？我們用ATP的水解酶和ATP受體抑制劑來抑制ATP的信號，我們發(fā)現(xiàn)巨噬

4、細(xì)胞不能到達(dá)損傷位置。同時我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣信號在血管損傷后馬上有明顯的上升。這些數(shù)據(jù)表明內(nèi)皮細(xì)胞在損傷后可以通過分泌ATP來招募巨噬細(xì)胞。
　　在少數(shù)的情況下兩個或兩個以上的巨噬細(xì)胞會分別粘附血管損傷的兩端。這時損傷不會被修復(fù)。腦血管損傷只有在兩個端口同時被一個巨噬細(xì)胞粘附的情況下才能被修復(fù)。這個結(jié)果排除了巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子修復(fù)損傷。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)巨噬細(xì)胞粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上后，粘附連接蛋白的聚集會出現(xiàn)在兩種細(xì)胞的粘附位點(diǎn)。這

5、些數(shù)據(jù)表明巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了粘附連接。
　　偽足的回縮可以產(chǎn)生很大的拉力，這種拉力是依賴于myosin II的。我們用抑制劑抑制了myosin II的活力后發(fā)現(xiàn)血管修復(fù)也可以被抑制。而偽足的骨架是微絲。我們用標(biāo)記微絲的轉(zhuǎn)基因系觀察，發(fā)現(xiàn)微絲在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間富集。而后我們用微絲的抑制劑處理，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞到達(dá)后不能伸出偽足產(chǎn)生粘附，修復(fù)不能完成。在修復(fù)過程中加入微絲抑制劑同樣能抑制修復(fù)。所以巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)是依賴于微絲產(chǎn)

6、生的機(jī)械拉力。
　　為了研究血管修復(fù)中的分子機(jī)制，三個修復(fù)時期的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞被分別收集，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械力和細(xì)胞粘附的基因和信號途徑有著明顯的變化。其中PI3K和Rac1通路在這些基因中變化明顯。而后我們研究了這兩個分子的作用。用抑制劑的方式抑制PI3K發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的修復(fù)能被抑制。對于Rac1用化學(xué)和遺傳的方法抑制都能使修復(fù)受到影響，所以這兩種分子對修復(fù)有著重要的作用。
　　抑制巨噬細(xì)胞移動到損傷位

7、點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)血管會自己緩慢修復(fù)，所以還存在一種不依賴巨噬細(xì)胞的血管修復(fù)方式。我們發(fā)現(xiàn)這種修復(fù)是依賴微管的延伸而不是依賴于微絲。并且這種修復(fù)方式要比巨噬細(xì)胞依賴的修復(fù)方式耗費(fèi)更多的時間，修復(fù)效率也更低。我們發(fā)現(xiàn)這種自我延伸會被巨噬細(xì)胞的粘附所停止。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞自我延伸時，頂端的Rac1的活力會降低，人為的抑制Rac1會加速內(nèi)皮細(xì)胞的自我延伸。Rac1的活力降低也許是兩種修復(fù)方式不同的分子基礎(chǔ)。
　　我們的研究在斑馬魚中構(gòu)建了

8、一個新的腦出血模型。與以前的模型相比，可以進(jìn)行高分辨率的實(shí)時觀察，了解腦中風(fēng)后的細(xì)胞學(xué)行為。另外這個模型可以方便的進(jìn)行分子生物學(xué)的研究，這在以前的動物模型中很難達(dá)到。我們的研究揭示了巨噬細(xì)胞通過直接的機(jī)械作用修復(fù)損傷，這是對巨噬細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子起功能的一個補(bǔ)充。巨噬細(xì)胞和損傷內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，為解釋炎癥和血管疾病的成因提供了新的視角。研究中的新發(fā)現(xiàn)為臨床提供了一些新的意見，加速巨噬細(xì)胞對腦血管損傷的修復(fù)可能對治療腦中風(fēng)和腦微出