工業(yè)鏈霉菌中磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的研究及應(yīng)用.pdf

1、許多鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有很強(qiáng)的生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物大部分由聚酮合酶(PKS)和非核糖體肽合成酶（NRPS）合成，酰基載體蛋白(ACP)/肽基載體蛋白(PCP)分別是PKS/NRPS的核心結(jié)構(gòu)域。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)催化PKS中ACP、NRPS中PCP以及脂肪酸合酶(FAS)中ACP的輔基化，對(duì)PKS、NRPS和FAS的活性起不可或缺的作用，PPTase根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異可以分為

2、Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
　　本論文首先研究了4個(gè)細(xì)菌中PPTase的功能。納他霉素工業(yè)菌株恰塔努加鏈霉菌L10含有2個(gè)PPTase，通過體外生化反應(yīng)和體內(nèi)基因敲除表征了它們的功能;通過改造輔基化網(wǎng)絡(luò)得到了一株納他霉素產(chǎn)量提高、發(fā)酵周期縮短的高產(chǎn)菌株。他克莫司(FK506)工業(yè)菌株筑波鏈霉菌YN06含有5個(gè)PPTase，是已知物種中PPTase數(shù)量最多的，體外表征結(jié)果表明5個(gè)PPTase都具有催化ACP/PCP輔基化的活性，它們對(duì)ACP

3、/PCP的底物選擇性各不相同。絕大部分細(xì)菌都含有至少1個(gè)Ⅰ型PPTase和至少1個(gè)Ⅱ型PPTase，而流感嗜血桿菌RD和藍(lán)藻Synechocystis sp.PCC6803中都是僅含有一個(gè)Ⅱ型PPTase（分別為Hppt和Sppt），體外表征結(jié)果表明兩者既能催化次級(jí)代謝Ⅰ型PKS中ACP的輔基化，也能夠催化初級(jí)代謝FAS中ACP的輔基化。
　　本論文其次研究了Ⅱ型PPTase結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。對(duì)于鎂離子結(jié)合殘基與活性的關(guān)系，將Sc

4、hPPT和Hppt中鎂離子結(jié)合殘基進(jìn)行突變，體外生化反應(yīng)和體內(nèi)表征結(jié)果表明第一和第三個(gè)鎂離子結(jié)合殘基是PPTase活性所必需的，而第二個(gè)鎂離子結(jié)合殘基對(duì)PPTase活性重要但并非必需。對(duì)于Ⅱ型PPTase的N端/C端與底物選擇性的關(guān)系，體外表征結(jié)果表明SchPPT的N端對(duì)其活性不可或缺， SchPPT的C端可能決定其底物選擇性。
　　本論文最后初步研究了Ⅱ型PPTase的進(jìn)化規(guī)律。已知的Ⅱ型PPTase可以分為3個(gè)鎂離子結(jié)合殘基型

5、（含Asp-Glu-Glu三聯(lián)體）和2個(gè)鎂離子結(jié)合殘基型（含Asp-Xxx-Glu三聯(lián)體），以上兩個(gè)三聯(lián)體的第二個(gè)殘基在相似的物種中具有相對(duì)保守性;蛋白同源性分析與基因同線性分析結(jié)果暗示，動(dòng)物中Ⅱ型PPTase來自于同一個(gè)祖先，植物中2個(gè)鎂離子結(jié)合殘基型PPTase來自于同一個(gè)祖先，植物中3個(gè)鎂離子結(jié)合殘基型PPTase可能來自于原核生物的基因水平轉(zhuǎn)移。
　　綜上所述，本論文表征了9個(gè)PPTase的功能，研究了Ⅱ型PPTase結(jié)構(gòu)