大鼠腦缺血再灌注后Cathepsin L 與細(xì)胞自噬的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的自噬體、溶酶體的形態(tài)學(xué)變化，檢測cathepsin L及自噬相關(guān)蛋白LC3II表達(dá)的變化；觀察cathepsinL特異性抑制劑 Z-FY-DMK對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞自噬的影響。
　　方法：
　　將大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、干預(yù)組，后三組再分為3h、6h、12h、24h這四個時間點。應(yīng)用改良的Longa線栓法制作

2、大鼠腦缺血再灌注損傷模型（MCAO），正常組無特殊處理，假手術(shù)組插線深度為9±0.5mm。干預(yù)組在術(shù)前30分鐘側(cè)腦室穿刺注射Z-FY-DMK（1nmol，5ulDMSO），假手術(shù)組及模型組在術(shù)前30分鐘側(cè)腦室注入等體積的DMSO溶液。采用Longa’s的5級標(biāo)準(zhǔn)評分法評價各組大鼠腦缺血再灌注后各時間點的神經(jīng)功能缺損。采用TTC染色觀察各組大鼠腦缺血再灌注后24h的腦組織梗死灶。采用Western bolt檢測cathepsin L及自噬

3、相關(guān)蛋白LC3II在各組各時間點表達(dá)的變化。采用電鏡觀察自噬體、溶酶體的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功率88.89％。
　　2.TTC染色正常組、假手術(shù)組未見腦組織梗死灶；模型組和干預(yù)組缺血側(cè)皮質(zhì)可見蒼白色梗死灶，干預(yù)組梗死面積較模型組減小，且干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能評分較模型組改善。
　　3.電鏡觀察正常組及假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞核膜完整、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，可以觀察到溶酶體的存在，數(shù)量較少

4、，未見自噬體。模型組3小時可見溶酶體數(shù)量增多、體積增大，可觀察到出現(xiàn)自噬體；6~12h自噬體、溶酶體數(shù)量顯著增多，可觀察到自噬體包裹的細(xì)胞器殘體，可觀察到呈泡狀的自噬溶酶體；24小時仍可見自噬體、溶酶體，但數(shù)量較前均有所減少。干預(yù)組各時間點鏡下所見與模型組相似，但自噬體、自噬溶酶體等結(jié)構(gòu)數(shù)量較之減少。
　　4.Westernbolt檢測cathepsin L：正常組、假手術(shù)組各時間點cathepsin L的表達(dá)相同；模型組cath

5、epsin L的表達(dá)在大鼠腦缺血再灌注3h、6h、12h呈上升趨勢，12h達(dá)到高峰，24h下降，各時間點表達(dá)量均高于假手術(shù)組。干預(yù)Cathepsin L在各時間點的表達(dá)趨勢與模型組相同，各時間點的表達(dá)量均高于假手術(shù)組，低于模型組。
　　5.Western bolt檢測 LC3II蛋白：正常組、假手術(shù)組各時間點LC3II蛋白的表達(dá)相同；模型組LC3II蛋白的表達(dá)在大鼠腦缺血再灌注3h、6h、12h呈上升趨勢，12h達(dá)到高峰，24h下