外源性線粒體對大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞活性及功能的影響.pdf

1、本文從以下幾方面進行論述：
　　第一部分：外源性線粒體的提取和功能研究。
　　目的：有研究顯示，細胞或組織上提取的線粒體可以保持其原有的活性和功能，維持其原有的完整性。同時也發(fā)現(xiàn)，嚙齒動物細胞系中分離的線粒體可以成功地注射到同源性的卵母細胞或者單細胞胚胎中。這里我們用重組質(zhì)粒編碼珊瑚蟲紅色熒光蛋白2與人類細胞色素C氧化酶中線粒體靶向序列的融合蛋白（Plasmid encodes a fusion of Discosoma s

2、p. Red fluorescent protein and the mitochondrial targeting sequence from subunit VIII of human cytochrome Coxidase，pDsRed2-Mito），用以轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO），提取特異性標(biāo)記的線粒體，觀察其功能和對神經(jīng)細胞的選擇性。
　　方法：用重組質(zhì)粒pDsRed2-M

3、ito轉(zhuǎn)染并單克隆CHO細胞，以構(gòu)建穩(wěn)定表達紅色熒光線粒體的鼠源性細胞株（Mitochondria-CHO，Mito-CHO）。熒光檢測線粒體在Mito-CHO細胞內(nèi)的表達情況。另外，組織上提取線粒體，熒光檢測肝源性線粒體提取后被MitoTracker Deep Red FM標(biāo)記的情況。從Mito-CHO細胞中分離線粒體，運用JC-1（檢測線粒體膜電位的熒光探針）試劑盒檢測線粒體提取后的膜電位改變。細胞熒光觀察不同來源的外源性線粒體進入

4、原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞的選擇性。激光共聚焦顯微鏡層掃進一步檢測外源性線粒體進入大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞的情況。
　　結(jié)果：細胞熒光結(jié)果顯示，單克隆并擴大培養(yǎng)后的Mito-CHO細胞株可以完全表達紅色熒光標(biāo)記的線粒體；而且MitoTracker? Deep Red FM可以標(biāo)記小鼠肝臟線粒體。JC-1法檢測線粒體提取后的膜電位，發(fā)現(xiàn)線粒體提取后與CHO細胞（Con：100±12.64％，n=3）中的線粒體膜電位一致（Mito：99.24±5.

5、39%，n=3，p>0.05 vs control），即提取后的線粒體膜電位正常。細胞熒光觀察發(fā)現(xiàn)，從 Mito-CHO細胞以及小鼠肝臟上提取的線粒體均可以進入大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞。這種作用具有細胞選擇性，即Mito-CHO細胞上提取的線粒體僅能進入大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，而不能進入大鼠皮層及海馬神經(jīng)元。激光共聚焦顯微鏡層掃進一步觀察外源性線粒體進入大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞的情況發(fā)現(xiàn)，外源性線粒體確實是進入到細胞內(nèi)，而不是附著在胞

6、膜外。
　　結(jié)論：Mito-CHO細胞中提取的線粒體功能沒有改變。外源性線粒體對培養(yǎng)的神經(jīng)細胞具有選擇性，只能進入大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，而不能進入大鼠皮層及海馬神經(jīng)元。
　　第二部分：外源性線粒體對大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞的作用。
　　目的：線粒體參與星形膠質(zhì)細胞的ATP供能、離子緩沖、谷氨酸氧化等過程，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如抑郁癥、認(rèn)知、自閉癥和精神分裂癥等中發(fā)揮重要作用。這里我們主要研究外源性給予線粒體后對星形膠

7、質(zhì)細胞的活性和功能的影響。
　　方法：熒光檢測Mito-CHO細胞上提取的線粒體進入大鼠皮層正常星形膠質(zhì)細胞的濃度和時間梯度。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法確定H2O2損傷星形膠質(zhì)細胞的孵育條件。JC-1法檢測外源性線粒體對正常和H2O2損傷的星形膠質(zhì)細胞膜電位的

8、影響。再用 MTT法檢測外源性線粒體對星形膠質(zhì)細胞活性的影響。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）法檢測外源性線粒體對正常和H2O2損傷的星形膠質(zhì)細胞凋亡情況的影響。細胞遷移實驗檢測外源性線粒體對星形膠質(zhì)細胞劃痕損傷的保護作用。
　　結(jié)果：熒光觀察外源性線粒體進入正常星形膠質(zhì)細胞的濃度依賴性發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，外源性線粒體給予越多，進入

9、細胞內(nèi)的數(shù)量也就越多，其中1×106個細胞給予24μg線粒體孵育24h，大部分外源性線粒體已進入星形膠質(zhì)細胞。MTT法研究發(fā)現(xiàn)，給予400μM H2O2（Con：100±13.40%；400μM：48.95±5.40%，n=5， p<0.01 vs control）以及H2O2孵育1h（Con：100±21.92%；1h：38.97±13.12%，n=7，p<0.05 vs control）顯著損傷星形膠質(zhì)細胞。JC-1法檢測外源性線粒

10、體進入細胞后的膜電位改變，發(fā)現(xiàn)正常（Con：100±6.16%；Con+Mito：92.35±2.56%，n=3，p>0.05 vs control）和H2O2損傷（H2O2：78.02±7.36%，n=3，p<0.01 vs control；H2O2+Mito：78.89±13.65%，n=3，p>0.05 vs H2O2）的星形膠質(zhì)細胞給予外源性線粒體前后的線粒體膜電位均不受影響。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，外源性線粒體對正常（Con：1

11、00±20.35%；Con+Mito：95.66±28.35%，n=5-6，p>0.05 vs control）和H2O2損傷（H2O2：90.07±18.76%，n=6，p<0.05 vs control；H2O2+Mito：83.94±15.51%，n=6，p>0.05 vs H2O2）的星形膠質(zhì)細胞的活性無影響；其中與Con組相比，由于與孵育外源性線粒體24h平行操作，導(dǎo)致H2O2組細胞活性稍有下降，可能因為細胞活性于24h后稍有

12、恢復(fù)。運用TUNEL法檢測外源性線粒體對正常和損傷星形膠質(zhì)細胞凋亡情況的影響，發(fā)現(xiàn)外源性線粒體對正常星形膠質(zhì)細胞的凋亡情況無影響（Con：100±33.56%；Con+Mito：107.78±15.40%，n=3，p>0.05 vs control），而可以明顯改善H2O2損傷模型的凋亡情況（H2O2：1316.4±115.47%，n=3，p<0.01 vs control；H2O2+Mito：390.48±128.84%，n=3，p<

13、0.01 vs H2O2）。通過細胞劃痕實驗研究外源性線粒體對正常和損傷星形膠質(zhì)細胞的保護作用，結(jié)果顯示，劃痕24h后，預(yù)先給予外源性線粒體的星形膠質(zhì)細胞遷移的細胞數(shù)（Con：100±8.73%；Mito：157.56±13.89%，n=3，p<0.01 vs control）比未加線粒體的Scratch組遷移的細胞數(shù)多。
　　結(jié)論：每1×106個細胞給予24μg外源性線粒體在37oC、5%CO2中孵育24h，大部分線粒體能進入星