重組七鰓鰻VLRB蛋白功能的初步研究.pdf

1、七鰓鰻是無頜類脊椎動物的代表，它的進化地位處于無脊椎動物與脊椎動物之間，它有著獨特的進化地位和可變淋巴受體VLR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的防御體系，所以受到免疫學(xué)家的注意。VLR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)分為3種不同的亞型(VLRA、VLRB、VLRC)，七鰓鰻的VLRB細(xì)胞更接近于B淋巴細(xì)胞，VLRA、VLRC細(xì)胞接近于T淋巴細(xì)胞。因此對于VLRB的研究具有深刻的意義。
　　本文構(gòu)建了七鰓鰻pColdⅠ-VLRB原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并進行純化得

2、到高純度的重組包涵體蛋白，作為抗原進行免疫。制備特異性和效價較高的抗七鰓鰻VLRB兔多克隆抗體，VLRB多抗的制備為后續(xù)的功能實驗提供了便利的條件。文章還構(gòu)建了七鰓鰻pIRES2-AcGFP1-Nuc-VLRB真核重組表達(dá)質(zhì)粒，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將VLRB的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到哺乳細(xì)胞293T細(xì)胞中，通過免疫熒光的方法確定VLRB在293T細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，用WB的方法確定VLRB表達(dá)于293T細(xì)胞的分泌液中，收集轉(zhuǎn)染72h后的細(xì)胞

3、分泌液經(jīng)過親和層析純化的方法，獲得了可溶的VLRB蛋白，為VLRB后續(xù)功能的研究排除了原核表達(dá)沒有轉(zhuǎn)錄后修飾和包涵體表達(dá)等對VLRB功能的影響。通過WB、免疫組化、免疫熒光等方法鑒定了VLRB在七鰓鰻組織中的表達(dá)情況與定位分析，結(jié)果顯示VLRB在血清、類淋巴細(xì)胞、腸、肝、腎、鰓、神經(jīng)軸體、心臟等組織中都有表達(dá)，且VLRB在鰓、神經(jīng)軸體、腎等組織中的表達(dá)量相對較高。用LPS抗原刺激七鰓鰻機體后在肝臟、腸、鰓等組織中VLRB的表達(dá)量與刺激前

4、比較出現(xiàn)了顯著性的差異，結(jié)果表明VLRB可能是七鰓鰻行使免疫功能的重要參與者。通過驗證VLRB對MCF-7細(xì)胞、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有殺傷作用，此結(jié)果可能說明VLRB不能直接參與殺傷功能，通過鑒定VLRB與C1q和C3，intelectin免疫分子都存在相互作用，可能說明VLRB協(xié)同這些免疫分子行使免疫功能。
　　綜上所述可知在七鰓鰻中VLRB不能直接參與病原體殺傷功能，它可能是通過與其它分子共同作用協(xié)同行使免疫功能，這為我