重組日本七鰓鰻rLj-RGD3與其五種突變體蛋白抗血管新生活性的比較.pdf

1、Lj—RGD3為來自于七鰓鰻口腔腺的含有三個(gè)RGD模體的毒素蛋白，其除具有RGD模體這一典型RGD毒素蛋白特征外，還與富含組氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性。由于RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性，但作用靶點(diǎn)不同，為了研究Lj—RGD3結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，本文對(duì)野生型Lj—RGD3進(jìn)行了RGD模體缺失突變，包括：三個(gè)RGD的全缺失突變體Lj—112；僅保留第1位RGD的突變體Lj—113；僅保留第2位RGD的突變體Lj—114；

2、僅保留第3位RGD的突變體Lj—115；將三個(gè)RGD全部突變?yōu)镵GD的突變體Lj—116。本課題對(duì)上述突變體蛋白與野生型之間進(jìn)行了生物學(xué)活性的比較，以確定其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。具體方法為：將突變基因全序列合成后構(gòu)建于pET—23b載體，對(duì)各蛋白進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)組氨酸親和層析純化。MTT結(jié)果表明，rLj—RGD3與各突變體蛋白均以劑量依賴方式抑制bFGF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞增殖，rLj—RGD3的IC50為0．889μmol/L，

3、rLj—112的IC50為0．160μ mol/L，rLj—113的IC50為0．215μ mol/L，rLj—114的IC50為0．143μmol/L，rLj—115的IC50為0．150μ mol/L，rLj—116的IC50為0．529μ mol/L。運(yùn)用雞絨毛尿囊膜(CAM)模型結(jié)果顯示，rLj—RGD3與各突變體蛋白均能抑制CAM的血管新生，且同等劑量條件下rLj—112的作用較強(qiáng)。采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板檢測(cè)各蛋白對(duì)

4、bFGF誘導(dǎo)下細(xì)胞遷移的抑制作用，結(jié)果表明，rLj—RGD3與突變體蛋白rLj—112、rLj—113、rLj—114、rLj—115和rLj—116均能抑制ECV304細(xì)胞的遷移，抑制率分別為50％、63％、42％、65％、70％和40％。利用人工基質(zhì)膜基質(zhì)Matrigel及Transwell模仿體內(nèi)環(huán)境研究rLj—RGD3與五種突變體蛋白對(duì)ECV304細(xì)胞浸澗的抑制作用，結(jié)果顯示，以bFGF為趨化劑的ECV304細(xì)胞穿透№trige

5、l的浸潤(rùn)行為均明顯受到抑制，且rLj—112的抑制功能較強(qiáng)。整合素連接激酶ILK—1的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rLj—RGD3與五種突變體蛋白均能下調(diào)ECV304細(xì)胞ILK—1的表達(dá)。上述結(jié)果表明，野生型rLj—RGD3與其五種不同的突變體蛋白rLj—112、rLj—113、rLj—114、rLj—115和rLj—116均具有抑制血管新生功能，且突變體Lj—112的活性相對(duì)于野生型和其他突變體蛋白較高，這說明Lj—112為HRG功能蛋白