TLR5和NLRC4通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和部分免疫細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:通過重組鞭毛素蛋白探究TLR5和NLRC4通路在抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用及其對(duì)小鼠中性粒、NK細(xì)胞、DC和Treg細(xì)胞的影響。
　　方法：試驗(yàn)中用到四種重組鞭毛素蛋白：FliC（激活TLR5和 NLRC4），F(xiàn)liCΔ90-97(激活NLRC4)，F(xiàn)liC-L3A（激活TLR5），F(xiàn)liCΔ90-97:L3A（不激活TLR5和NLRC4）。
　　1.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和鎳離子親和層析法純化重組沙門氏菌鞭毛素蛋白，通過

2、檢測(cè)IL-8和IL-1β檢驗(yàn)重組鞭毛素蛋白激活TLR5和 NLRC4的生物學(xué)活性。
　　2.qRT-PCR法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中TLR5和NLRC4的表達(dá)；采用CCK8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組鞭毛素蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，Western-blot檢測(cè)NF-κB(TLR5)和P10(NLRC4)通路激活情況。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠中性粒細(xì)胞，NK細(xì)胞，DC和Treg的比例及表面分子。<

3、br>　　結(jié)果：
　　1.重組鞭毛素蛋白的純度>95％，內(nèi)毒素殘留<0.01EU/mg蛋白，重組鞭毛素蛋白具有生物學(xué)活性。
　　2.重組鞭毛素蛋白對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞有抑制作用，在0.1μg/ml時(shí)，MCF-7細(xì)胞各組抑制率>20%。Western-blot結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞FliC和FliC-L3A組胞核蛋白中NF-κB高于對(duì)照組，F(xiàn)liC和FliCΔ90-97組檢測(cè)到caspase1 P10片段

4、。
　　3.流式結(jié)果顯示FliC、FliCΔ90-97和FliC-L3A使腹腔中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞比例增加，分別為（8.41±0.04）%和(9.9±2.6)%；（9.1±2.1）%和（10.3±0.3）%；（8.0±0.3）%和（11.0±2.6）%，PBS組為（2.6±1.3）%和(3.2±0.2)%。FliC和FliC-L3A組DC細(xì)胞上CD80和CD86表達(dá)上調(diào)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。FliC-L3A組調(diào)