雷洛昔芬對(duì)鎘誘導(dǎo)腎損傷致1-α羥化酶變化的干預(yù).pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取和體外培養(yǎng)SD大鼠的腎小管上皮細(xì)胞并建立氯化鎘染毒的細(xì)胞模型，檢測(cè)氯化鎘染毒24h后以及雷洛昔芬干預(yù)氯化鎘染毒24h后的SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的增殖情況，以及雷洛昔芬對(duì)氯化鎘誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞損傷致1-α羥化酶的變化的干預(yù)，為臨床上干預(yù)鎘中毒引起的骨質(zhì)疏松開(kāi)辟新思路。
　　方法：選取10只新生（出生不足24h）SD大鼠，SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代的提取以及分離純化采用Percoll密度梯度離心法，用細(xì)胞形態(tài)學(xué)

2、鑒定法對(duì)所提取的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。對(duì)于原代的培養(yǎng),培養(yǎng)液所含胎牛血清的濃度需高些（本研究所用濃度為15％）；對(duì)于傳代細(xì)胞的培養(yǎng)，本研究使用的的濃度為10%。本研究所包含的全部檢測(cè)方法均選取第3代腎小管上皮細(xì)胞。細(xì)胞相對(duì)生存率的檢測(cè)采用MTT法，應(yīng)用不同劑量（2.5、5、10、20、40μmol/L）的氯化鎘對(duì)腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行染毒，處理時(shí)間為24h；應(yīng)用不同劑量的雷洛昔芬（0.05、0.1、0.5、1μmol/L）以及固定劑量的氯

3、化鎘（20μmol/L）共同處理細(xì)胞，處理時(shí)間為24h。將腎小管上皮細(xì)胞分為：A組（對(duì)照組）：應(yīng)用不添加任何試劑的低糖培養(yǎng)基10ml處理細(xì)胞；B組（氯化鎘組）：應(yīng)用含有20μmol/L氯化鎘的低糖培養(yǎng)液10ml處理細(xì)胞；C組（雷洛昔芬組）：應(yīng)用含有20μmol/L氯化鎘以及0.1μmol/L雷洛昔芬的低糖培養(yǎng)液10ml處理細(xì)胞，處理時(shí)間為24h。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)：1.三組腎小管上皮細(xì)胞總RNA的提?。哼x取Trizol法；2.逆轉(zhuǎn)錄：

4、選用天跟逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；3.目的片段的擴(kuò)增：選用RT-PCR法；4.1-α羥化酶基因的表達(dá)水平的檢測(cè)。選取SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：未貼壁SD大鼠腎小管上皮原代細(xì)胞為球狀，培養(yǎng)2d后細(xì)胞完全貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)4~5d左右細(xì)胞可長(zhǎng)滿(mǎn)10cm皿底，培養(yǎng)的傳代細(xì)胞呈多邊鵝卵石鋪路石狀；本研究RT-PCR結(jié)果：A組腎小管上皮細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合緊密，細(xì)胞形態(tài)

5、正常；B組腎小管上皮細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合不緊密，大部分細(xì)胞形態(tài)異常，大量細(xì)胞死亡；C組與B組的腎小管上皮細(xì)胞相比，細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合較為緊密，較少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。MTT實(shí)驗(yàn)顯示：各鎘染毒組細(xì)胞增值情況與對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.01），細(xì)胞增值情況與鎘濃度呈反比，20μmol/L CdCl2作用24h即可使腎小管上皮細(xì)胞增值情況由100.00%下降至51.82%；各雷洛昔芬干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞增值情況與鎘染毒組相比顯著升高（P＜0.

6、01），0.1μmol/L RAL干預(yù)24h后可使腎小管細(xì)胞的增值情況升高至168.85%。RT-PCR研究顯示：B組1-α羥化酶基因的表達(dá)與A組相比顯著下降（P﹤0.01）；C組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)1-α羥化酶基因的表達(dá)與B組相比明顯增高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：氯化鎘對(duì)腎小管上皮細(xì)胞具有毒性損傷作用，損傷作用隨著劑量增高而增強(qiáng)，雷洛昔芬對(duì)于氯化鎘染毒的腎小管上皮細(xì)胞具有干預(yù)作用，且不同劑量的雷洛昔芬干預(yù)效果不同。其機(jī)制可能是通