Ph樣ALL體外藥敏篩選方法的建立及初步臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：建立體外酪氨酸激酶抑制劑藥敏篩選系統(tǒng)，探討在體外篩選Ph樣ALL的方法，幫助臨床進(jìn)行更精確的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）危險(xiǎn)度分層，使患者獲益有效的靶向治療藥物，提高患者的緩解率及改善預(yù)后。
　　方法：
　　1.首先用Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)法檢測并描繪細(xì)胞活力曲線，檢測不同濃度酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼作用于BCR-ABL陽性的人急性白血病細(xì)胞系K562、BV173和NUP214-ABL

2、1融合基因陽性的人急性白血病細(xì)胞系SIL-ALL及人類急性白血病細(xì)胞系697、NALM6、SHI-1、HL-6024小時(shí)后的增殖抑制作用。
　　2.采用密度梯度離心法分離初診急性白血病患者骨髓液標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞，并用CCK-8法檢測不同濃度酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼作用114例不同初治急性白血病類型的原代新鮮白血病細(xì)胞72小時(shí)后的增殖抑制作用。結(jié)合急性白血病患者細(xì)胞及分子遺傳學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析預(yù)測。
　　3.用SPSS22．0統(tǒng)計(jì)軟

3、件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。細(xì)胞活性的組間差異使用student’s t-test或者two-way ANOVA檢驗(yàn)方法。所有分析的方法均采用雙邊分析方法，并且P<0.05(*)，P<0.01(**),P<0.001(***)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.K562、BV173和SIL-ALL的平均細(xì)胞活性高于697、NALM6、SHI-1、HL-60細(xì)

4、胞系平均細(xì)胞活性的40％～60%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且K562、BV173、SIL-ALL三者的細(xì)胞活性都隨著藥物濃度的增加而降低。
　　2.用苔盼藍(lán)拒染試驗(yàn)方法測定AL原代新鮮細(xì)胞活細(xì)胞率為92％-99％之間，平均活細(xì)胞率為(96.16±2.37)％,而凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活細(xì)胞率為64％-85.69％之間，平均活細(xì)胞率為(72.85±5.62)％，表明細(xì)胞凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活性下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.急

5、性髓細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病原代白血病細(xì)胞密度為2×106cells/ml時(shí)鋪板最理想。
　　4.酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼對Ph+AL初診白血病細(xì)胞的體外藥敏作用
　　3例初診Ph+急性白血病患者原代白血病細(xì)胞24，48以及72小時(shí)后，白血病細(xì)胞平均細(xì)胞活性分別降低23.37±5.25%、31±6.43%、51±8.64%，達(dá)沙替尼處理原代細(xì)胞72小時(shí)抑制率較明顯，并且在達(dá)到1nm抑制濃度后三者的細(xì)胞活性不再隨著藥物濃

6、度的增加而降低。
　　5.酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼對AML初診白血病細(xì)胞的體外藥敏作用
　　14例AML患者初診白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼敏感，其中7例患者FLT3-ITD突變，3例患者C-kit突變，3例患者CBFB-MYH11融合基因陽性，1例患者BCR-ABL融合基因陽性；40例 AML患者初診白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼不敏感，其中5例患者AML-ETO融合基因陽性，3例患者FLT3-ITD突變,3例患者FLT3-TKD突變,8例

7、患者CEBPA雙突變，4例患者NPM1突變，2例患者PML-RARα融合基因陽性，2例DNMT3A突變，1例患者M(jìn)LL-AF6融合基因陽性，1例患者M(jìn)LL-AF10融合基因陽性。
　　6.酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼對B-ALL初診白血病細(xì)胞的體外藥敏作用
　　21例B-ALL患者初診白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼敏感，其中有18例患者BCR-ABL融合基因陽性，其他3例患者未發(fā)現(xiàn)常見的染色體、融合基因及基因突變異常。20例B-ALL患者

8、原代細(xì)胞對達(dá)沙替尼不敏感，亦沒有發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合基因等其他常見遺傳學(xué)異常。
　　7.酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼對T-ALL初診白血病細(xì)胞的體外藥敏作用
　　2例患者的白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼敏感，其中1例患者基因突變檢測發(fā)現(xiàn)有PTEN突變，另外1例患者未發(fā)現(xiàn)常見的染色體、融合基因及基因突變異常。12例T-ALL患者原代細(xì)胞對達(dá)沙替尼不敏感，其中有1例患者檢測到SET-CAN融合基因轉(zhuǎn)錄本，1例患者檢測到MLL-AF6融合基因

9、轉(zhuǎn)錄本，4例NOTCH1突變，3例患者FBXW7突變，1例NRAS突變。
　　8.酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼對HAL初診白血病細(xì)胞的體外藥敏作用
　　2例HAL患者的初診白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼敏感，他們BCR-ABL融合基因陽性，3例HAL患者的初診白血病細(xì)胞對達(dá)沙替尼不敏感，其中有1例患者檢測到NOTCH1及NRAS突變。
　　結(jié)論：
　　1.達(dá)沙替尼能抑制BCR-ABL陽性與NUP214-ABL1陽性的急性白血病

10、細(xì)胞系的生長；
　　2.進(jìn)行CCK8體外藥敏試驗(yàn)選用的AL患者的原代細(xì)胞需為新鮮細(xì)胞，凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活力差，影響CCK8試驗(yàn)結(jié)果。
　　3.達(dá)沙替尼能抑制BCR-ABL陽性、部分FLT3-ITD突變、CBFB-MYH11、C-kit突變急性白血病患者原代白血病細(xì)胞的生長。
　　4.在體外成功建立了酪氨酸激酶抑制劑藥敏篩選系統(tǒng)，并確定了該體外藥敏檢測技術(shù)的最佳條件，CCK8酪氨酸激酶抑制劑體外藥敏試驗(yàn)與分子遺傳學(xué)特點(diǎn)符