促紅細胞生成素對骨髓間充質(zhì)干細胞來源微泡修復腎臟纖維化影響的研究.pdf

1、目的:既往研究表明骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)在細胞和組織損傷的修復中發(fā)揮了重要作用。促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)可以提升MSC在組織和器官損傷中的修復作用。MSC外泌的微囊泡(Microvesicle，MV)可以修復急慢性腎損傷。因此，進一步研究EPO對MSC外泌的MV在修復腎臟纖維化方面的影響。
　　方法:收集并提取常規(guī)培養(yǎng)條件下MSC來源的MV(MSC-M

2、Vs)和經(jīng)過不同濃度EPO（1，10，100和500 IU/mL）共培養(yǎng)條件下MSC來源的MV(EPO-MVs)。體外實驗:轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導人腎近曲小管上皮細胞系(HK2)發(fā)生纖維化，并用MSC-MVs和EPO-MVs進行干預治療。運用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測HK2細胞的表型改變，流式細胞儀檢測各

3、實驗組HK2細胞的凋亡情況。體內(nèi)實驗:建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO)的腎臟損傷模型，MSC-MVs和EPO-MVs干預治療后通過腎臟組織病理，腎臟纖維化標志蛋白改變及腎功能指標變化來評估各實驗組小鼠的腎臟功能。運用miRNA的微列陣來檢測MSC-MVs和EPO-MVs內(nèi)各自miRNA表達譜，尋找出其內(nèi)差異表達miRNA，并運用軟件進行靶基因預測。
　　結(jié)果:與常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC組相比，在1-100 IU/mL EPO共培養(yǎng)條

4、件下的EPO-MSC其外泌MV的含量隨著EPO刺激濃度的增加呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。100IU/ml EPO濃度下提取的EPO-MVs相較于常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC-MVs在體外TGF-β1誘導HK2纖維化時，EPO-MVs的干預治療比MSC-MVs有更顯著的效果。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，MSC-MVs和EPO-MVs均可一定程度上減輕由TGF-β1誘導的HK2細胞凋亡，并且EPO-MVs的效果更佳。在體內(nèi)實驗中，最優(yōu)EPO濃度下提取的EPO

5、-MVs在7天和14天對UUO小鼠的腎臟損傷修復中呈現(xiàn)了比常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC-MVs更好的治療效果。此外，MSC-MVs和EPO-MVs的miRNA表達譜對比分析結(jié)果顯示，EPO-MVs中共有212個miRNAs表達發(fā)生變化，其中有70.28％的miRNA是表達上調(diào)的（包括miR-299a-3p，miR-449b，miR-302b-5p和miRNA-200a-3p）。這些上調(diào)變化的miRNA可能是造成EPO-MVs在腎臟損傷修復作用