苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A表達量影響的作用研究.pdf

1、第一部分不同抑菌濃度苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A表達量的影響
　　目的:
　　本實驗采用LB肉湯—腹膜透析外接硅膠管系統(tǒng)建立大腸埃希菌體外細菌生物膜模型，探討在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期，不同抑菌濃度的苦參堿對大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)表達量的影響。
　　方法:
　　用二倍稀釋法分別測量苦參堿和左氧氟沙星對大腸埃希菌的最低抑菌濃度(MIC)。將經過高壓蒸汽滅菌的腹膜透析管載體置入無菌的24孔板中，隨機分為

2、6組:空白對照組（陰性對照組）、1/2MIC左氧氟沙星組（陽性對照組）、1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組。從開始建立大腸埃希菌生物膜模型時，就將藥物加入藥物干預組調成相應的藥物濃度。于生物膜早（1天）、中（3天）、晚(7天)期，分別利用細菌蛋白抽提試劑提取24孔板中細菌總蛋白，通過蛋白質印跡法(Western blot)檢測不同時間、不同藥物及濃度下大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)

3、的表達量。
　　結果:
　　在不同藥物抑菌濃度的干預下，1/2MIC苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組與空白對照組相比較，無論在生物膜早（1天）、中（3天）、晚（7天）期，大腸埃希菌外膜蛋白A(ompA)的表達量均減少(P＜0.05)，且不同濃度苦參堿組之間對ompA蛋白表達量的影響統(tǒng)計學無明顯差異（P＞0.05）。
　　結論:
　　1/2MIC

4、苦參堿組、1/4MIC苦參堿組、1/8MIC苦參堿組、1/16MIC苦參堿組及1/2MIC左氧氟沙星組在大腸埃希菌生物膜早、中、晚期均能抑制其外膜蛋白A(ompA)的表達。
　　第二部分大腸埃希茵OmpA蛋白原核表達載體的構建
　　目的:
　　對大腸埃希菌的外膜蛋白A基因（ompA）進行克隆，鑒定，構建原核基因表達載體，為構建OmpA過表達菌株奠定基礎。
　　方法:
　　以大腸埃希菌K12菌株基因組DNA為

5、模板，用PCR法擴增基因ompA，接著用酶切、連接、轉化等系列方法，將此基因克隆到原核表達載體pET-32a(+)中構建重組質粒ompA-pET-32a，并通過PCR進行驗證，將初步驗證正確的重組質粒進行測序鑒定。將鑒定正確的重組體轉化入表達宿主Ecoli Rosetta菌株內，為后續(xù)對轉化菌株Rosetta以IPTG進行誘導做準備。
　　結果:
　　經PCR鑒定、DNA測序驗證構建的重組質粒，證實ompA基因正確地插入到p