一種具有CaPi礦化外殼的新型肺炎鏈球菌減毒活疫苗的構建及其免疫保護效果及機制的初步探究.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）是一種能夠引起肺炎、中耳炎、敗血癥、腦膜炎等一系列疾病的主要病原微生物之一，對于兒童和老年人的危害尤為突出。疫苗是預防和控制肺炎鏈球菌感染的一種有效手段。目前上市的有23價莢膜多糖疫苗和7~13價莢膜多糖結合疫苗，但它們存在免疫原性弱、血清型覆蓋不廣或易引起莢膜血清型轉換等缺點。因此，研制新型的、更理想的S.pn疫苗已成為預防其感染的一項重要課題。肺炎鏈球菌

2、減毒活疫苗SPY1是本課題組前期獲得的一株2型肺炎鏈球菌D39的突變菌株。該菌株沒有莢膜且毒力顯著降低，作為疫苗免疫小鼠后，安全性較高、保護效果好，甚至優(yōu)于目前上市的疫苗。而且其保護作用不依賴于莢膜的存在，因此對于各種血清型的肺炎鏈球菌都有抵抗作用，屬于血清型非依賴型疫苗，具有進一步開發(fā)的潛質(zhì)。然而，該疫苗存在大多數(shù)疫苗共有的缺點即熱穩(wěn)定性差，需要冷藏保存，并且該疫苗免疫原性不強，需要佐劑輔助才能發(fā)揮良好的免疫保護作用。有文獻報道，采用

3、仿生礦化技術在活酵母細胞和病毒表面形成一礦化層后，其熱穩(wěn)定性和免疫原性均得以提高，但尚未見到對活細菌疫苗進行礦化的報道。因此，本研究旨在對SPY1進行原位礦化，進而提高SPY1的熱穩(wěn)定性及其免疫原性，并進一步對其免疫保護效果及機制進行初步探究，為肺炎鏈球菌活菌疫苗的進一步研發(fā)奠定基礎。
　　方法：以肺炎鏈球菌D39基因組DNA為模板設計合成構建突變體lytA基因所需引物，采用插入失活的方法構建SPY1-△lytA突變株，并以缺陷菌

4、的生長特性以及 PCR的方法進行鑒定；將 SPY1-△lytA突變株于富鈣環(huán)境中培養(yǎng)，用不同濃度的磷酸鹽進行滴定，使其形成磷酸鈣礦化殼，通過掃描電鏡以及直接熒光反應來檢測疫苗菌株礦化情況；并將礦化菌株與未礦化菌株同時置于37℃環(huán)境條件下，通過比較各組細菌在不同時間點的存活量來評價礦化菌的熱穩(wěn)定性；將礦化菌株SPY1-△lytA-CaPi黏膜免疫C57BL/6小鼠，從免疫后小鼠抗肺炎鏈球菌鼻腔定植的能力初步評估其保護效果，通過檢測免疫后小

5、鼠體內(nèi)的抗原特異性 IgG及細胞因子水平，初步探究該礦化疫苗的免疫保護機制。
　　結果：PCR結果以及細菌長時間不溶解的生長特性表明成功構建了SPY1-△lytA突變株；掃描電鏡以及直接熒光反應結果顯示細菌表面形成CaPi礦化外殼，并且SPY1-△lytA-CaPi礦化菌具有較好的熱穩(wěn)定性；黏膜免疫 C57BL/6小鼠后，與未礦化疫苗組相比，礦化疫苗SPY1-△lytA-CaPi可以降低肺炎鏈球菌19F在小鼠鼻腔內(nèi)的定植，并且可以

6、刺激高水平的IL-17A、IL-10產(chǎn)生，提示該礦化疫苗可以引起Th17以及Treg型細胞免疫應答，初步顯現(xiàn)了較好的免疫保護效果。
　　結論：成功構建了肺炎鏈球菌減毒活疫苗SPY1（無自溶活性）的礦化菌株，不僅提高了疫苗菌株SPY1的自身穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，使得該疫苗脫離冷鏈運輸成為可能，同時還提高了SPY1的免疫原性，使其在可以不依賴佐劑的情況下，達到良好的免疫保護效果，可謂一舉兩得。該新型礦化疫苗的研制及其免疫效果的初步評價將進