肺炎鏈球菌ZmpB蛋白疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，S.pn)作為最重要的人類病原菌之一能夠引起危及生命的侵襲性疾病，尤其是在老人和小孩中。其造成的死亡在美國及歐洲是所有能夠用疫苗預(yù)防疾病中最高的，而在世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)的死亡是發(fā)生在發(fā)展中國家。由于耐藥問題的愈發(fā)嚴(yán)重，疫苗已經(jīng)成為防治S.pn的重點(diǎn)。
　　 鋅金屬蛋白酶(Zinc metalloprotease B，ZmpB)存在于所有分離出的肺

2、炎鏈球菌中[15]，其作為一個(gè)毒力因子能夠誘導(dǎo)下呼吸道腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生。用基因展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZmpB的抗原位點(diǎn)能夠與77％的成人血清反應(yīng)，高于PspA的60%。這些結(jié)果提示ZmpB可能是肺炎鏈球菌一個(gè)良好的新疫苗靶點(diǎn)。肺炎鏈球菌DnaJ(HSP40)作為熱休克蛋白之一，具有高度的保守性，用粘膜以及腹腔免疫后均能夠抵御多種肺炎鏈球菌的攻擊。肺炎鏈球菌溶血素(Ply)是近年來廣泛研究的候選疫苗蛋白，其無溶血活性突變體ΔA14

3、6 Ply能針對(duì)肺炎鏈球菌感染產(chǎn)生良好的保護(hù)作用。
　　 本文擬在評(píng)價(jià)ZmpB作為疫苗候選蛋白的潛力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其與DnaJ、Ply聯(lián)合后的保護(hù)效果。
　　 方法：
　　 在大腸桿菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)ZmpB重組蛋白(保守區(qū)段)，免疫BALB/C小鼠得到抗ZmpB的多克隆抗體。通過Western blot鑒定ZmpB在不同肺炎鏈球菌菌株中的表達(dá)情況；評(píng)價(jià)ZmpB蛋白以及抗ZmpB多抗對(duì)于S.pn介導(dǎo)的A54

4、9細(xì)胞粘附的影響；ELISA方法檢測(cè)免疫后血清中的抗體亞型以及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌情況。對(duì)ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單個(gè)蛋白粘膜免疫后小鼠用不同菌株進(jìn)行定植實(shí)驗(yàn)以及生存率的評(píng)價(jià)。并對(duì)ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單一或聯(lián)合通過腹腔途徑免疫小鼠，通過鼻腔和腹腔兩種攻毒方式分別評(píng)價(jià)其抵擋S.pn定植和抵抗S.pn引起敗血癥感染的能力，并利用各組特異性的抗血清進(jìn)行被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：

5、>　　 本研究成功表達(dá)了包含成熟ZmpB蛋白15到590氨基酸的多肽，其純度＞90%。Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)抗ZmpB多克隆抗體能夠與2型，3型，6B，14以及19F型的肺炎鏈球菌裂解物反應(yīng)，其反應(yīng)區(qū)帶大約在210Kda(ZmpB全長蛋白分子量)處。無論是ZmpB的重組蛋白還是抗ZmpB的多抗都能夠有效抑制肺炎鏈球菌與A549細(xì)胞的粘附作用。粘膜免疫ZmpB后能夠刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10、IFN-γ和IL-17A

6、，并刺激小鼠產(chǎn)生以IgG1為主抗體亞型；并能夠顯著降低19F以及14型肺炎鏈球菌在肺部的定植，提高2型，3型，6B以及14型菌攻毒后小鼠的生存時(shí)間。用重組ZmpB與DnaJ和ΔA146 Ply進(jìn)行聯(lián)合的腹腔免疫，與單個(gè)蛋白免疫相比能夠顯著提高對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)力(p＜0.05)；被動(dòng)免疫實(shí)驗(yàn)同樣證明了用這三種蛋白聯(lián)合免疫后得到的高免疫狀態(tài)的抗血清得到的保護(hù)效果好于單個(gè)抗血清(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 Zm