亞硝酸鹽對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體生成及遷移侵襲能力的影響.pdf

1、背景：亞硝酸鹽是癌啟動(dòng)劑的觀念已經(jīng)根深蒂固，然而目前尚缺乏亞硝酸鹽致癌的直接實(shí)驗(yàn)性依據(jù)。近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)低劑量的亞硝酸鹽具有降血壓、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和減輕器官缺血再灌注損傷的藥理作用。在將亞硝酸鹽開發(fā)為臨床藥物之前，必須了解亞硝酸鹽對(duì)合并癌癥患者的影響。癌的發(fā)生發(fā)展不僅需要癌的啟動(dòng)，而且依賴癌的促進(jìn)。癌的促進(jìn)包括癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞的這些行為都需要能量，線粒體是能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。線粒體是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，通過線粒

2、體生成和線粒體自噬調(diào)控線粒體質(zhì)量。線粒體質(zhì)量的變化與癌的促進(jìn)關(guān)系密切。了解亞硝酸鹽對(duì)癌細(xì)胞線粒體生成的作用，對(duì)進(jìn)一步研究亞硝酸鹽的促癌作用有重要意義。
　　目的：研究亞硝酸鹽對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞線粒體生成的影響，為亞硝酸鹽促癌這一觀點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：用系列濃度的亞硝酸鈉在常氧下孵育人肝癌SMMC-7721細(xì)胞24 h，用MTT法測(cè)定吸光度值反映細(xì)胞活力；用ROS示蹤劑觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化；Trans

3、well小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；用微絲示蹤劑染色應(yīng)力纖維和偽足、Mito-Tracker Red染色線粒體，在熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)、數(shù)量及分布情況；RT-PCR檢測(cè)線粒體標(biāo)志分子 COXⅠ和 COXⅣ基因的表達(dá)；在激光共聚焦顯微鏡下觀察被 Mito-Tracker Green染色的線粒體的質(zhì)量變化；HIF-1ɑ、線粒體生成標(biāo)志分子 PGC-1α和細(xì)胞色素 C蛋白的表達(dá)水平用Western blot方法檢測(cè)。
　　結(jié)果：

4、MTT法結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 mg·L?1亞硝酸鈉作用24h對(duì)細(xì)胞活力的促進(jìn)作用最強(qiáng)；ROS示蹤劑DCFH-DA孵育細(xì)胞，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉明顯增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，亞硝酸鈉孵育細(xì)胞24 h，可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力；微絲示蹤劑和Mito-Tracker Red共染色，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉促進(jìn)應(yīng)力纖維和偽足增加，線粒體呈現(xiàn)核周分布，以上現(xiàn)象均可以被活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acety

5、lcysteine, NAC)抑制；RT-PCR結(jié)果顯示，亞硝酸鈉明顯降低線粒體標(biāo)志分子COXⅠ和COXⅣ基因的表達(dá)；Mito-Tracker Green染色，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉明顯減少線粒體質(zhì)量；Western blot結(jié)果顯示，HIF-1ɑ蛋白表達(dá)水平升高，線粒體生成標(biāo)志分子PGC-1α和細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平降低，這些現(xiàn)象同樣被NAC所逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：低劑量亞硝酸鈉通過ROS/HIF-1ɑ途徑減少人肝癌SMM