原兒茶醛對大鼠心肌干細胞體外增殖的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  原兒茶醛(PCA),是從中藥丹參中提取的一種水溶性單體,具有較強的抗缺氧能力,和擴張冠狀動脈,增加冠血流量的療效。本實驗擬選取適宜的培養(yǎng)條件及操作方法,成功從SD大鼠心臟中分離出純度高、生物活性好的CSCs,研究不同濃度PCA對大鼠CSCs體外增殖作用的影響,以及PCA促進CSCs體外增殖,與P i3k-Akt信號通路調(diào)控細胞周期進程的關(guān)系,為后續(xù)實驗提供理論依據(jù)。
  方法:
  選用1-3日齡的SD大鼠

2、,酶消化的方法分離培養(yǎng)出心肌干細胞,第二代CSCs與不同濃度的PCA(0.16 mM,0.42 mM,1.26 mM,3.78 mM和11.34 mM)共培養(yǎng),24h,48h,72h后用MTT比色法檢測PCA對CSCs的影響;不同濃度的PCA(0.42mM,1.26mM,3.78 mM)與CSCs共培養(yǎng)24 h,C-kit熒光抗體標記,流式細胞儀測定c-k it+的干細胞的比率,最終確定出 PCA的最佳給藥劑量和時間;通過 C-kit熒

3、光抗體標記,流式細胞儀分選的方法,進一步提高 c-kit+CSCs的比率,選取純化后的第二代CSCs,用C-kit和K i-67熒光抗體分別標記細胞膜和細胞核,免疫熒光鑒定的方法檢測c-kit+CSCs的純化; PCA與純化后的CSCs共培養(yǎng)24 h,流式細胞術(shù)分析細胞周期不同階段所含 CSCs的比率;RT-qPCR法檢測細胞周期進程相關(guān)基因的表達,即Pi3k,Akt,CyclinD,CDK4,Ki-67,PCNA的mRNA的表達水平,

4、以及干細胞相關(guān)基因C-kit和Sca-1的mRNA的表達;進一步采用Western Blot免疫印跡實驗考察基因Pi3k,Akt1和PCNA蛋白表達水平。
  結(jié)果:
  經(jīng)過消化分離的心臟組織,3d之后,成纖維樣細胞逐漸從組織塊兒的邊緣逸出,并逐漸相互交聯(lián)形成細胞層。1周后,可見一些小、圓、亮的細胞附著在成纖維細胞層上。收集纖維層上小細胞,經(jīng)過傳代培養(yǎng),細胞呈現(xiàn)出棒狀梭型,且形態(tài)均一,延長細胞生長時間,CSCs聚集交融,逐

5、漸形成類似于太陽形狀的集落。
  MTT法檢測表明,與對照組相比,PCA作用后的CSCs生長增殖迅速,24h后,當PCA的濃度為0.16mM,0.42mM,1.26mM,3.78mM和11.34mM時,CSCs增殖具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01),48 h的檢測結(jié)果與24 h的相似,72 h后,當PCA的濃度為0.42mM,1.26mM,3.78mM時,CSCs增殖具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01

6、),但是,隨著時間的延長,CSCs的增殖程度降低。流式細胞術(shù)檢測顯示,0.42mM,1.26 mM和3.78 mM的PCA與細胞培養(yǎng)24 h后,c-k it+CSCs比率達到19.6%,41.0%和17.6%,與空白組6.9%相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
  細胞周期分析的結(jié)果顯示,在S期,0.42mM,1.26 mM和3.78 mM作用過的CSCs的細胞比率分別為10.27±2.61%,22.44±2.77%和9.

7、00±2.56%,與對照組5.11±2.89%相比,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05 or P<0.01);在G2/M期,0.42 mM,1.26 mM和3.78 mM作用過的CSCs的細胞比率分別為8.72±2.57%,2.56±1.88%和7.34±2.87%,與對照組5.54±2.61%相比,0.42mM和3.78 mM組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),1.26mM組細胞比率顯著低于對照組;在G0/G1期,0.42 mM,1.26 m

8、M和3.78 mM作用過的CSCs的細胞比率分別為81.07±3.39%,73.99±3.00%和83.67±3.21%,與對照組89.35±3.22%相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01)。
  RT-qPCR結(jié)果顯示,1.26 mM組的P i3k的表達水平,以及0.42 mM,1.26 mM,3.78mM組的Akt、CyclinD、CDK4的表達水平,與空白組 CSCs相比顯著上調(diào)(P<0.05 or P

9、<0.01);1.26mM組的Sca-1的表達水平,和3.78mM組的PCNA的表達水平,以及0.42mM,1.26 mM,3.78 mM組的C-k it及K i-67的表達水平,與空白組CSCs相比顯著上調(diào)(P<0.05 or P<0.01)。
  Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,0.42mM,1.26mM,3.78mM的PCA作用于CSCs后,Pi3k蛋白和PCNA蛋白的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05 or P<0.

10、01),Akt1蛋白的表達水平,在0.42mM和1.26 mM的PCA組顯著上調(diào)(P<0.05 or P<0.01),但是在3.78mM的PCA作用下,Akt1蛋白的表達水平下調(diào)。
  結(jié)論:
  在新生的SD大鼠心肌組織中,存在有C-kit+CSCs,且CSCs在體外能夠自我更新和分裂增殖; PCA可促進CSCs的體外增殖; PCA可上調(diào)Pi3k,Akt,CyclinD, CDK4,C-kit,Sca-1,Ki-67和PC

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