HIF-2α和沙利度胺影響GIVM發(fā)生發(fā)展和血管生成的機制研究.pdf

1、第一部分：HIF-2α和沙利度胺對斑馬魚腸下血管發(fā)生發(fā)育的影響
　　目的：明確HIF-2α和沙利度胺對斑馬魚腸下血管發(fā)生發(fā)育的影響。
　　方法：使用HIF-2α過表達質(zhì)粒對VEGF標記的Tg(fli1a:EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚進行顯微注射，觀察斑馬魚腸下靜脈表型，對腸下靜脈出芽情況進行計數(shù)；對HIF-2α過表達斑馬魚胚胎給予不同濃度的沙利度胺干預（200uM、400uM、800uM），觀察斑馬魚腸下靜脈出芽情況；使用PC

2、R方法檢測斑馬魚VEGF、NOTCH、DLL4等血管生成信號通路的表達差異。
　　結果：HIF-2α過表達后將導致斑馬魚腸下靜脈出芽明顯增加（4.20±1.48個，P<0.05 vs.對照組）；在沙利度胺干預后，斑馬魚腸下靜脈出芽顯著減少，尤其在給予800uM沙利度胺干預時，部分斑馬魚腸下靜脈表型與正常對照組類似；HIF-2α過表達后，VEGF、NOTCH1a、NOTCH1b、NOTCH2、DLL4表達均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，并且沙

3、利度胺能夠抑制上述基因的表達。
　　結論：HIF-2α能夠誘導斑馬魚腸下靜脈異常出芽，并且沙利度胺能夠逆轉(zhuǎn)這一作用；HIF-2α能夠促進VEGF、NOTCH、DLL4的表達；沙利度胺能夠抑制HIF-2α誘導的血管生成信號通路的活化。
　　第二部分：HIF-2α和沙利度胺對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組表達的影響
　　目的：明確HIF-2α和沙利度胺對斑馬魚轉(zhuǎn)錄組表達的影響；探討沙利度胺對內(nèi)皮細胞非編碼小RNA的調(diào)控；預測核仁素和snoR

4、NA之間的結合強度和位點。方法：使用高通量轉(zhuǎn)錄組測序芯片對HIF-2α過表達和HIF-2α過表達+沙利度胺干預的斑馬魚胚胎模型進行測序分析；使用高通量small RNA測序芯片對沙利度胺干預前后的HUVEC進行測序分析；使用CatRAPID平臺對核仁素和snoRNA進行生物信息學預測分析；使用Western Blot和PCR對芯片結果進行驗證。
　　結果：三組斑馬魚樣本轉(zhuǎn)錄組測序分析提示HIF-2α和沙利度胺對血管生成通路中VEG

5、F通路和NOTCH通路存在影響；沙利度胺對核糖體生成通路的表達存在影響，其中核仁素的表達存在差異；HUVEC非編碼小RNA測序發(fā)現(xiàn)，沙利度胺干預后有13個snoRNA表達出現(xiàn)差異；其中SNORA31是唯一一個沙利度胺干預后表達穩(wěn)定升高的snoRNA；生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，SNORA31能夠和核仁素高強度的結合，并預測了兩者之間的高概率結合位點。
　　結論：HIF-2α和沙利度胺對血管生成通路具有調(diào)控作用；沙利度胺能夠影響轉(zhuǎn)錄組中核糖

6、體生成通路的表達，其中能夠使核仁素表達出現(xiàn)差異；沙利度胺能夠使SNORA31表達增高；SNORA31能夠以較高強度和核仁素蛋白結合。
　　第三部分：SNORA31抑制核仁素細胞膜表達初探
　　目的：初步探討SNORA31對核仁素細胞膜表達的抑制作用。
　　方法：使用免疫組化法驗證核仁素在小腸血管畸形患者中的表達；使用小管生成實驗驗證細胞膜表面核仁素對HUVEC成管的作用；使用細胞免疫熒光法檢測Lenti-SNORA31

7、轉(zhuǎn)染HUVEC細胞膜核仁素表達情況，觀察SNORA31-siRNAs干擾后細胞膜核仁素表達情況，研究SNORA31片段對HUVEC細胞膜核仁素表達的抑制作用。
　　結果：免疫組化提示在小腸血管畸形標本中，血管內(nèi)皮細胞核仁素表達升高；在抑制了HUVEC表面核仁素之后，HUVEC成管能力顯著下降；干擾SNORA31表達后，HUVEC細胞膜表面核仁素表達有增高趨勢；過表達SNORA31將減少核仁素在細胞膜的表達；包含H BOX區(qū)域的SN