Wnt5a對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞體外成骨、成脂分化的影響.pdf

1、目的：通過(guò)建立Wnt5a過(guò)表達(dá)和沉默的根尖牙乳頭干細(xì)胞（SCAP）細(xì)胞系，檢測(cè)其相關(guān)成骨及成脂因子的表達(dá)，探討 Wnt5a對(duì) SCAP體外成骨、成脂分化的影響，為Wnt5a調(diào)控SCAP的生物學(xué)作用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　通過(guò)體外酶消化法及有限稀釋法純化培養(yǎng)人根尖牙乳頭干細(xì)胞（SCAP），并進(jìn)行鑒定。構(gòu)建Wnt5a過(guò)表達(dá)和沉默的慢病毒載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SCAP，獲得Wnt5a過(guò)表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系，并

2、以嘌呤霉素篩選；qRT-PCR檢測(cè)SCAP中Wnt5a的mRNA表達(dá)，Western Blot檢測(cè)Wnt5a的蛋白表達(dá)。將Wnt5a過(guò)表達(dá)SCAP和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空載體對(duì)照組進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別在2周、3周和4周終止誘導(dǎo)，提取細(xì)胞RNA，qRT-PCR檢測(cè)ALP、BSP、DSPP、OCN的mRNA表達(dá)；提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)ALP、BSP、DSPP、OCN的蛋白表達(dá)。將Wnt5a過(guò)表達(dá)SCA

3、P和Wnt5a沉默SCAP以及各自的空載體對(duì)照組進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，提取細(xì)胞RNA，qRT-PCR檢測(cè)PPAR-γ的mRNA表達(dá)；提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot檢測(cè)PPAR-γ的蛋白表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1. Wnt5a慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了SCAP，轉(zhuǎn)染率近90％；Wnt5a過(guò)表達(dá)組與空載體組相比其mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），Wn

4、t5a沉默組顯著降低（P<0.05）。建立了Wnt5a過(guò)表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系。
　　2. SCAP成骨相關(guān)礦化因子的表達(dá)：
　?。?）ALP：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組比較ALP的mRNA表達(dá)量降低（P<0.05），蛋白表達(dá)量升高（P<0.05）；Wnt5a沉默組與對(duì)照組比較ALP的mRNA表達(dá)量差異不明顯（P>0.05），蛋白表達(dá)量降低（P<0.05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組mRNA及蛋白表達(dá)均高于沉默組（

5、P<0.05）。誘導(dǎo)3周及4周，與對(duì)照組相比，Wnt5a過(guò)表達(dá)組ALP的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組均降低（P<0.05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組mRNA及蛋白表達(dá)均高于沉默組（P<0.05）。
　?。?）BSP：礦化誘導(dǎo)2、3、4周，與對(duì)照組相比，Wnt5a過(guò)表達(dá)組BSP的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組表達(dá)量均降低（P<0.05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組BSP的mRNA及蛋白

6、表達(dá)均高于沉默組（P<0.05）。
　　（3）DSPP：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組比較DSPP的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組與對(duì)照組比較DSPP的mRNA表達(dá)量降低（P<0.05），但Wnt5a沉默組未檢測(cè)到蛋白表達(dá)；Wnt5a過(guò)表達(dá)組DSPP的mRNA表達(dá)高于沉默組（P<0.05）。誘導(dǎo)3周和4周，與對(duì)照組相比，Wnt5a過(guò)表達(dá)組 DSPP的mRNA及蛋白表達(dá)量升高（P<0.05），

7、Wnt5a沉默組表達(dá)量降低（P<0.05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組DSPP的mRNA及蛋白表達(dá)均高于沉默組（P<0.05）。（4） OCN：礦化誘導(dǎo)2周，Wnt5a過(guò)表達(dá)組及沉默組與對(duì)照組比較OCN的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組OCN的mRNA及蛋白表達(dá)均低于沉默組（P<0.05）。誘導(dǎo)3周及4周，Wnt5a過(guò)表達(dá)組OCN的mRNA及蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05），Wnt5a沉默組低于對(duì)照組（P<0.

8、05）；Wnt5a過(guò)表達(dá)組OCN的mRNA及蛋白表達(dá)均高于沉默組（P<0.05）。
　　3. SCAP相關(guān)成脂因子 PPAR-γ：與對(duì)照組相比，Wnt5a過(guò)表達(dá)組 PPAR-γ的mRNA及蛋白表達(dá)量均升高（P<0.05），Wnt5a沉默組均降低（P<0.05），Wnt5a過(guò)表達(dá)組較沉默組表達(dá)量升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Wnt5a過(guò)表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染率近90%。<

9、br>　　2. Wnt5a過(guò)表達(dá)在體外能夠上調(diào)SCAP細(xì)胞礦化因子ALP、BSP、DSPP、OCN表達(dá)；Wnt5a沉默則下調(diào)以上因子的表達(dá)。以礦化誘導(dǎo)3周及4周變化明顯。
　　3. Wnt5a過(guò)表達(dá)在體外能夠上調(diào) SCAP細(xì)胞成脂因子 PPAR-γ的表達(dá)；Wnt5a沉默則下調(diào)其表達(dá)。
　　4.本研究條件下，初步證實(shí) Wnt5a對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞體外成骨、成脂分化具有促進(jìn)作用。為牙根發(fā)育的分子機(jī)制和將來(lái)臨床治療及組織工程利用