NGF基因重組慢病毒感染大鼠肌源干細(xì)胞及目的基因的表達(dá)檢測.pdf

1、背景：隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，肌源干細(xì)胞治療壓力性尿失禁成為研究熱點，在前期研究中，通過比較不同消化酶聯(lián)合方法，得到最佳消化分離大鼠肌源干細(xì)胞（MDSCs)的方式。但在MDSCs注射到大尿道周圍以后，如何提高肌肉組織功能的恢復(fù)，以便更好的改善壓力性尿失禁，則是人們更加期待的問題。神經(jīng)生長因子（NGF）是最早被發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)生長因子,對神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、分化和再生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,是參與損傷神經(jīng)再生和功能修復(fù)的重要因子,兼有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起

2、生長雙重作用。
　　目的：本實驗將利用MDSCs感染率高的慢病毒載體同時攜帶NGF基因，對大鼠MDSCs進(jìn)行基因修飾，在體外觀察目的基因的表達(dá)和目的蛋白的分泌，探討NGF基因修飾的MDSCs對提高尿道功能修復(fù)的作用效果，為下一步將基因修飾的MDSCs注入尿道周圍治療大鼠壓力性尿失禁奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分采用酶聯(lián)合消化法、差速貼壁技術(shù)對大鼠肌源干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察肌源干細(xì)胞的形態(tài)特征及生

3、長特點，采用MTT法繪制生長曲線，流式細(xì)胞儀對肌源干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　第二部分將PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因后載入慢病毒表達(dá)載體，與輔助包裝質(zhì)粒共感染293T細(xì)胞。將重組慢病毒顆粒感染第一部分得到的MDSCs，熒光顯微鏡下觀察感染的效率，感染成功后用PCR和Western Blot檢測NGF基因的表達(dá)及目的蛋白的分泌。
　　結(jié)果：采用酶聯(lián)合消化、差速貼壁技術(shù)可以成功得到MDSCs，其生長特點完全符合MDSCs特征，流式細(xì)胞儀鑒定