ABCG2特異性人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體的制備及化療增敏和放免顯像研究.pdf

1、目的：利用噬菌體展示肽庫技術(shù)制備并篩選出ABCG2特異性全人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體，驗(yàn)證其免疫學(xué)活性、增值抑制和順鉑增敏作用，放射性核素標(biāo)記抗體后進(jìn)一步行裸鼠體內(nèi)放免顯像研究，為臨床肺腺癌的化療耐藥逆轉(zhuǎn)和分子靶向治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法與結(jié)果：
　　第一部分、單鏈抗體庫的構(gòu)建
　　1．ScFv基因的合成：以肺腺癌患者癌旁陽性淋巴結(jié)為組織來源，提組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增VH和VL基因片段。以

2、VH和VL為模板繼續(xù)PCR，分別在其上下游加上Linker序列。等摩爾量的VH-Linker-和Linker+-VL片段經(jīng)SOE-PCR拼接成scFv片段。1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RCR產(chǎn)物大小并切膠回收各產(chǎn)物片段。結(jié)果顯示：提取的組織總RNA純度較好無降解，A260/A280比值達(dá)1.98；VH、VL、VH-Linker-、Linker+-VL及scFv產(chǎn)物大小分別為360bp、340bp、410bp、390bp和750bp，大小與預(yù)期

3、相符。
　　2．初級抗體庫的制備：純化的scFv片段經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后到與噬菌體表達(dá)載體pCANTAB5E連接。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TG1。質(zhì)粒PCR結(jié)果顯示scFv片段陽性插入率達(dá)100%（12/12），雙酶切鑒定正確，陽性質(zhì)粒行測序驗(yàn)證，序列比對結(jié)果與整碼的scFv編碼序列一致性可達(dá)99%。
　　3．噬菌體抗體的表達(dá)：2×YT培養(yǎng)液收集含陽性質(zhì)粒的平板，利用M13KO7輔助噬菌體感染誘導(dǎo)scFv片

4、段的融合表達(dá)。
　　第二部分、單鏈抗體的篩選、純化及免疫活性檢測
　　1．A549肺腺癌細(xì)胞和ABCG2純化抗原對抗體庫的聯(lián)合篩選：以A549細(xì)胞先對初級抗體庫進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的全細(xì)胞篩選，再用ABCG2抗原進(jìn)行3輪固相篩選。經(jīng)過6輪篩選，抗體庫效價由首輪1.54×10-6逐輪提升至1.7×10-4，滴度提升約110倍。
　　2．單鏈抗體scFv的可溶性表達(dá)和免疫活性鑒定：將噬菌體ELISA驗(yàn)證呈陽性的噬菌

5、體抗體感染E.coli HB2151，IPTG誘導(dǎo)scFv可溶性表達(dá)。經(jīng)HitrapTM Anti-E Tag親和層析柱純化后行SDS-PAGE電泳鑒定，同時以抗E-tag抗體為一抗（1:3,000）行Western-blot檢測，結(jié)果顯示在34 kDa處有一條清晰的條帶。以非靶向scFv為對照，ELISA和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測scFv的特異性發(fā)現(xiàn)該scFv與肺腺癌A549細(xì)胞的結(jié)合具有相對特異性。競爭ELISA結(jié)果顯示，當(dāng)抗體1:500稀

6、釋時，scFv對IgG的結(jié)合抑制率為4.56%±1.96%；1:1稀釋時，結(jié)合抑制率增加到68.09%±4.27%，表明該scFv對A549細(xì)胞具有較高的親和力。
　　第三部分、單鏈抗體的增殖抑制及化療增敏實(shí)驗(yàn)
　　1．CCK-8、克隆形成、遷移實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)：單鏈抗體scFv處理A549細(xì)胞48h后進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)scFv對細(xì)胞增殖呈時間依賴性抑制。克隆和遷移實(shí)驗(yàn)表明scFv能夠明顯抑制A549細(xì)胞的集落形

7、成和穿膜能力。凋亡和周期結(jié)果顯示，scFv誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率明顯增加（47.95%±5.43%vs.9.21%±2.38%,P<0.01），且細(xì)胞周期阻滯于G1期（70.70%±1.81%vs.52.44%±2.72%,P<0.01）。
　　2．單鏈抗體對肺腺癌細(xì)胞的化療增敏作用：A549細(xì)胞經(jīng)scFv處理后對順鉑的敏感性明顯增加，IC50值（5.31±0.49μg/mL vs.0.06±0.03μg/mL）隨scFv劑量增加

8、而減小。
　　3．單鏈抗體調(diào)節(jié)耐藥蛋白表達(dá)：A549細(xì)胞經(jīng)不同劑量scFv處理后，提取細(xì)胞總蛋白，行Western blot檢測。結(jié)果表明scFv能夠明顯下調(diào)ABCG2蛋白表達(dá)，且對ABC家族的其他成員MDR1也有一定的協(xié)同抑制作用。
　　第四部分、單鏈抗體的放免顯像研究
　　采用氯胺T法對單鏈抗體scFv進(jìn)行放射性核素131I的標(biāo)記。標(biāo)記后的scFv經(jīng)尾靜脈注射至荷人肺腺癌裸鼠體內(nèi)，測定不同時間點(diǎn)裸鼠體內(nèi)腫瘤及其他各

9、組織%ID/g（每克組織百分注射劑量率），并行SPECT/CT顯像。結(jié)果顯示：注射131I-scFv后，裸鼠體內(nèi)各組織對抗體的攝取量逐漸增加，以腫瘤組織最明顯，相應(yīng)的瘤/血、瘤/肌肉、瘤/腦的放射性比值呈逐漸升高趨勢并在第24 h達(dá)到峰值（3.45±1.06、4.51±0.89和23.65±3.00），隨后逐漸降低。SPECT/CT融合顯像發(fā)現(xiàn)腫瘤部位具有相對特異性的放射性聚集，以第24h顯像最清楚。
　　第五部分、單鏈抗體的體內(nèi)

10、抗腫瘤活性檢測
　　新鮮分離的A549細(xì)胞（2×106/100μL PBS）皮下注射至裸鼠背部，當(dāng)腫瘤生長至約500mm3左右時，將裸鼠隨機(jī)分為四組：生理鹽水NS組、單抗scFv組、順鉑DDP組和scFv+DDP聯(lián)合組（scFv10mg/kg,i.p.,d1-3 and DDP2.5mg/kg,i.p.,d4,7.），觀察兩組腫瘤體積變化情況。收集腫瘤組織，石蠟包埋切片，以Ki-67和cleaved caspase3抗體行免疫組化

11、染色以檢測增殖和凋亡。結(jié)果顯示scFv+DDP聯(lián)合組瘤體明顯小于對照組且具有明顯增加的cleaved caspase3和降低的Ki-67表達(dá)。
　　結(jié)論：本研究以噬菌體展示肽庫技術(shù)為基礎(chǔ)，制備并篩選出ABCG2特異性全人源肺腺癌噬菌體單鏈抗體，檢測抗體的免疫活性、化療增敏和體內(nèi)外增殖抑制作用，并經(jīng)放射性核素標(biāo)記后進(jìn)一步行體內(nèi)分布研究及放免顯像研究。結(jié)果表明成功篩選出ABCG2特異性人肺腺癌單鏈抗體，具有較高親和力和特異性，能夠有效