ApoM通過抑制NF-κB活性下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá).pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是臨床常見的慢性炎癥性疾病，炎癥和免疫反應(yīng)是其重要的發(fā)病機(jī)制。高密度脂蛋白(high-density lipoproteins，HDL)是參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵脂蛋白，具有重要的抗AS作用。已有研究證實(shí)HDL在動(dòng)脈硬化形成中還發(fā)揮重要的抗炎、抗氧化作用。載脂蛋白M(apolipoproteinM，apoM)是新近發(fā)現(xiàn)的一種與HDL功能和作用密切相關(guān)的載脂蛋白，這主要與apoM影響前β

2、-HDL的形成有關(guān)。在成人，apoM主要表達(dá)在肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和腎臟近端腎小管上皮細(xì)胞中。大量研究表明，apoM代謝異常與脂質(zhì)代謝、糖尿病、冠心病及AS等疾病的發(fā)病機(jī)制有高度相關(guān)性。
　　為進(jìn)一步探討apoM的抗炎機(jī)制，本研究以肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，首先采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)觀察TNF-α處理細(xì)胞后，細(xì)胞中apoM，ICAM-1，VCAM-1和IκBα的表達(dá)變化，然后檢測(cè)apoM對(duì)ICAM-1，V

3、CAM-1和IκBα表達(dá)的影響，最后以siRNA-apoM和/或TNF-α分別作用于HepG2細(xì)胞，觀察apoM對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞中ICAM-1，VCAM-1和IκBα表達(dá)以及NF-κB活性變化的影響，以進(jìn)一步明確apoM在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮抗炎作用可能的分子機(jī)制。
　　目的：
　　1).觀察TNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞中ICAM-1，VCAM-1，apoM及IκBα表達(dá)的影響;
　　2).觀察在HepG2細(xì)胞中，

4、apoM對(duì)ICAM-1，VCAM-1以及IκBα表達(dá)的影響;
　　3).觀察在TNF-α處理的HepG2細(xì)胞中，apoM對(duì)ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響是否通過調(diào)節(jié)NF-κB活性而實(shí)現(xiàn)。
　　方法：
　　細(xì)胞培養(yǎng)
　　人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國(guó)ATCC; HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃、5％ CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

5、r>　　RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書用TRIzol(Invitrogen)等試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞中的總RNA。然后將總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在ABI7500 FAST熒光定量PCR系統(tǒng)上，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)以人GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。反應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為Ct，

6、按照ΔΔCt方法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)變化。
　　Western Blot分析
　　根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明書提取HepG2細(xì)胞的總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，以每個(gè)上樣孔按照30μg計(jì)算上樣體積。然后在制備的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，孵育一抗抗體:anti-β-actin，anti-apoM，anti-ICAM-1，anti-VCAM-1和anti-IκBα抗體(Abcam)，4℃孵育過夜，孵

7、育后用辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG二抗抗體孵育，最后采用增強(qiáng)化學(xué)顯色方法(ECL)進(jìn)行曝光顯影。
　　siRNA-apoM轉(zhuǎn)染
　　apoM特異性小干擾片段(siRNA-apoM)購自廣州銳博生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染前一天，將HepG2細(xì)胞按照適量細(xì)胞數(shù)接種到含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，以次日細(xì)胞達(dá)30％-50％密度為宜。采用5μL脂質(zhì)體Lipo2000轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。置于37℃、5％ CO2、飽和濕

8、度的環(huán)境中培養(yǎng)48小時(shí)后，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)目的基因蛋白表達(dá)情況。
　　慢病毒載體轉(zhuǎn)染
　　構(gòu)建帶有GFP的慢病毒過表達(dá)載體LV-Mock和LV-apoM。將HepG2細(xì)胞按照適量細(xì)胞數(shù)接種到含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，以次日細(xì)胞達(dá)30％-50％密度為宜。置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，以慢病毒感染HepG2細(xì)胞病毒感染指數(shù)(MOI)為20進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將4μLPo

9、lybrene(8mg/mL)與稀釋好的病毒液同時(shí)加入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后置于37℃、5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染6-24小時(shí)更換新的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后96小時(shí)收集細(xì)胞檢測(cè)目的基因蛋白水平的表達(dá)。
　　NF-κB活性檢測(cè)
　　在siRNA-apoM和TNF-α處理HepG2細(xì)胞后提取細(xì)胞核蛋白，對(duì)提取的蛋白采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。將樣本加入到孵育有雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDN

10、A)生物素的ELISA板，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處讀取光密度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NF-κB的含量。
　　結(jié)果：
　　1.TNF-α下調(diào)HepG2細(xì)胞apoM及Iκ Bα表達(dá)，上調(diào)ICAM-1和VCAM-1表達(dá)。
　　TNF-α是一種重要的炎性介質(zhì)，首先我們觀察了TNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞中apoM，IκBα，ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響，我們以0ng/mL和10ng/mL的TNF-α分別處理HepG2細(xì)胞，采

11、用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中apoM，IκBα，ICAM-1和VCAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，TNF-α處理組HepG2細(xì)胞中apoM mRNA和蛋白表達(dá)水平以及IκBα蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而ICAM-1和VCAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.ApoM對(duì)IκBα，ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響。
　　ApoM是參與脂質(zhì)

12、代謝的重要載脂蛋白，但其在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制目前尚不明確，為進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制，首先我們將構(gòu)建的apoM慢病毒過表達(dá)載體(LV-apoM)和空載對(duì)照(LV-Mock)分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中IκBα，ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)情況。WesternBlot結(jié)果表明，LV-apoM轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中apoM表達(dá)升高9.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。說明慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)

13、染成功。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，LV-apoM實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分別顯著下調(diào)了57.8％和52.8％，而IκBα蛋白水平則顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.ApoM通過抑制NF-κB活性下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)。
　　Iκ Bα蛋白磷酸化和降解過程與NF-κB信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。第二部分我們觀察到過表達(dá)apoM可以引起IκBα蛋白水平顯著上調(diào)。為進(jìn)一步研

14、究apoM是否影響TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)及其可能的分子機(jī)制，本研究采用siRNA技術(shù)靶向沉默apoM，觀察其對(duì)IκBα，ICAM-1和VCAM-1等因子表達(dá)的影響。將siRNA-apoM轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，與對(duì)照組相比，siRNA-apoM組中apoM表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨之，在轉(zhuǎn)染siRNA-apoM的HepG2細(xì)胞中繼續(xù)加入0ng/mL或10ng/mL的TNF-α共孵育24小時(shí)，

15、實(shí)驗(yàn)分組如下:(1) siRNA-NC+0ng/mL TNF-α(Control組);(2)siRNA-apoM+0ng/mL TNF-α(siRNA-apoM組);(3) siRNA-NC+10ng/mL TNF-α(TNF-α組);(4) siRNA-apoM+10ng/mL TNF-α(siRNA-apoM+TNF-α組)。蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比較，siRNA-apoM組中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平分別上

16、調(diào)了93.3％和110.6％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與TNF-α組相比較，siRNA-apoM+TNF-α組細(xì)胞內(nèi)ICAM-1和VCAM-1蛋白水平則分別上調(diào)了200.8％和190.9％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)siRNA-apoM處理能進(jìn)一步增強(qiáng)TNF-α對(duì)IκBα的下調(diào)作用。提示apoM可能參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)，且該過程可能與NF-κB的活化密切相關(guān)。本研究

17、進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，siRNA-apoM+TNF-α組細(xì)胞中NF-κB活性上調(diào)了475.4％，而TNF-α組細(xì)胞則僅上調(diào)了160％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1).TNF-α上調(diào)HepG2細(xì)胞中ICAM-1，VCAM-1表達(dá)水平，下調(diào)apoM及IκBα表達(dá)水平;
　　2).ApoM下調(diào)HepG2細(xì)胞中ICAM-1，VCAM-1蛋白水平，上調(diào)IκBα蛋白表達(dá)水平;