脂肪細胞的新分泌蛋白PAMM對巨噬細胞炎性因子表達的調(diào)控作用研究.pdf

1、脂肪組織中的炎癥反應(yīng)與肥胖相關(guān)性代謝綜合癥密切相關(guān)，而巨噬細胞則在調(diào)節(jié)脂肪組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于脂肪組織具有活躍的分泌功能，推測該組織可分泌蛋白來調(diào)控巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥。我們結(jié)合基因表達譜和生物信息學技術(shù)來研究前脂肪細胞（3T3-L1細胞）的分化過程，分別對前脂肪細胞（3T3-L1細胞）和成熟脂肪細胞進行了全基因組微陣列篩選，搜索在成熟脂肪細胞中的被誘導(dǎo)高表達的基因，并進行基因測序分析、預(yù)測信號肽以及編碼蛋白，從而發(fā)現(xiàn)了巨噬

2、細胞集落刺激因子誘導(dǎo)單核細胞活化的似過氧化物酶2（Peroxiredoxin(PRX)-like2 activated in M-CSF stimulated monocytes，PAMM），PAMM是一個具有CXXC序列的含有類似過氧化物酶2結(jié)構(gòu)域的蛋白，是一種新的分泌蛋白并具有強大的抗炎特性。
　　PAMM是由成熟的人脂肪細胞分泌的蛋白。PAMM在白色和棕色脂肪組織中均高表達，并在肥胖狀態(tài)時進一步表達增加。PAMM的過表達可明

3、顯抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥。用培養(yǎng)了脂肪細胞的培養(yǎng)液和抗PAMM的抗體孵育巨噬細胞，可顯著增強LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞的炎性細胞因子的表達。此外，用提純的PAMM蛋白孵育RAW264.7細胞也有類似的抗炎作用。而且，在RAW264.7細胞中強制性過表達PAMM可導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的 ERK1/2，p38MAPK和JNK的磷酸化的減少，這表明PAMM很可能是通過抑制MAPK信號通路從

4、而發(fā)揮其抗炎的功能。失去抗氧化還原活性的PAMM CXXC結(jié)構(gòu)的突變體仍可抑制LPS刺激的巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的能力，這表明PAMM的抗炎特性可能并不依賴于其抗氧化特性。
　　第一部分、PAMM是來源于脂肪細胞的新型分泌蛋白
　　目的：搜索在成熟脂肪細胞中的被誘導(dǎo)高表達的基因、預(yù)測信號肽并編碼蛋白，確定PAMM是一種來源于脂肪細胞的分泌蛋白。
　　方法：①3T3-L1細胞與DMI（地塞米松，甲基黃嘌呤，和胰島素）孵

5、育15天誘導(dǎo)分化為脂肪細胞。細胞用油紅O染色進行分析，并采用Nikon顯微鏡系統(tǒng)拍攝細胞染色圖像。對未分化的3T3-L1細胞以及脂肪細胞進行微陣列分析來比較基因表達譜并進行相關(guān)的基因測序分析。DMI誘導(dǎo)3T3-L1細胞分化期間，用Northern blot和酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細胞內(nèi)及培養(yǎng)液中PAMM的表達。②分別用Flag-PAMM質(zhì)?；騀lag-MCP

6、IP1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞，并進行Western blot檢測，分析全細胞裂解液和培養(yǎng)基中的Flag-PAMM和 Fl+ag-MCPIP1。③Northern blot分析小鼠組織中PAMM mRNA的表達。給一個月月齡的野生型C57/BL6小鼠飼喂高脂飲食四個月，收集高脂飲食喂養(yǎng)不同時間后小鼠的白色脂肪組織，進行Northern blot分析。
　　結(jié)果：①3T3-L1細胞與地塞米松、甲基黃嘌呤、胰島素的混合分化液（DM

7、I）孵育后，能分化成為脂肪細胞。PAMM在脂肪細胞和在3T3-L1細胞中的表達相比上調(diào)8倍，核苷酸序列分析結(jié)果表明，PAMM包含一個開放閱讀框，編碼229個氨基酸的蛋白質(zhì)。其蛋白質(zhì)序列與過氧化物酶家族（Peroxiredoxins，Prxs）相似，并含有一個CXXC結(jié)構(gòu)。3T3-L1細胞分化15天時細胞裂解液和培養(yǎng)液中PAMM水平均明顯上調(diào)（P＜0.05）。②Flag-PAMM和Flag-MCPIP1都出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染的HEK293細胞全細胞

8、裂解液中，但只有flag-PAMM出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。③PAMM mRNA在小鼠組織中廣泛表達，但在脂肪組織中的表達最高。在小鼠高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的過程中，肥胖小鼠的脂肪組織中PAMM mRNA的顯著增加
　　小結(jié)：①PAMM是一個具有CXXC序列的含有類似過氧化物還原酶2結(jié)構(gòu)域的蛋白，3T3-L1前脂肪細胞的分化促進PAMM表達的上調(diào)。②PAMM是一個來源于脂肪細胞的新發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白。③PAMM在小鼠白色和棕色脂肪組織中均高表達，并在

9、肥胖小鼠的脂肪組織中進一步表達增加。
　　第二部分、PAMM顯著抑制巨噬細胞炎性因子的表達及機制研究
　　目的：觀察PAMM對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細胞炎性因子表達的影響，并探討其機制。
　　方法：①Flag-PAMM質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞24小時，收集細胞裂解物進行Western blot檢測；以磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）或0.1μg/ml

10、 LPS處理轉(zhuǎn)染后的RAW264.7細胞8小時，采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Quantitative PCR，qPCR）法檢測RAW264.7細胞的炎性細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synt

11、hase，iNOS）的表達。②DMI孵育3T3-L1細胞15天，使之分化成脂肪細胞；收集分化好的3T3-L1脂肪細胞的裂解液及其細胞培養(yǎng)液，進行western blot分析。在上述實驗獲得的培養(yǎng)液中加入抗PAMM抗體（1.0ng/ml）或IgG預(yù)孵育1小時后，再孵育Raw264.7細胞1小時，然后用PBS或0.1μg/ml LPS處理8小時，采用qPCR法檢測IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達水平。③Akata

12、wash法提純BL21大腸桿菌中PAMM蛋白。用0、0.1、0.5μg/ml純化的PAMM蛋白孵育RAW264.7細胞30分鐘，再用0.1μg/ml LPS刺激8小時。qPCR檢測細胞IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達水平。④PAMM表達質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞24小時，用0.1μg/ml的LPS處理0，15和60分鐘。Western blot檢測細胞裂解物中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extra

13、cellular signal-regulated kinases,ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)和IκB激酶β（Inhibit kappa B kinase beta，IKKβ）的總蛋白水平及磷酸化的情況。⑤PAMM表達質(zhì)粒或PAMM C88G突變體（在CXXC結(jié)

14、構(gòu)的88位置上的半胱氨酸殘基被甘氨酸取代）的表達質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞24小時，用PBS或400μM過氧化氫處理2小時，測定細胞胞漿中還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）的比值。用PBS或0.1μg/ml的LPS處理上述轉(zhuǎn)染細胞8小時，qPCR法檢測細胞IL-6、IL-8和iNOS mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：

15、①RAW264.7細胞被成功轉(zhuǎn)染并過表達PAMM后，能顯著減少由LPS誘導(dǎo)的炎性因子IL-1β、IL-6，IL-12和iNOS mRNA的表達（P＜0.001）。②在分化好的脂肪細胞的裂解液及其細胞培養(yǎng)液中均有PAMM蛋白的表達，而培養(yǎng)液中的PAMM的作用被抗PAMM抗體中和后，LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達顯著增加（P<0.001）。③提純的PAMM蛋白能劑量依賴性地抑制LP

16、S刺激的RAW264.7細胞的IL-1β、IL-6、IL-12和iNOS mRNA的表達（P<0.001）。④過表達PAMM顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞的 ERK1/2，p38MAPK和 JNK的磷酸化，而對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞的IKKβ的磷酸化則無抑制作用。⑤與過表達PAMM C88G突變體相比較，過表達PAMM則可顯著阻止由H2O2所導(dǎo)致的GSH/GSSG比值的降低（P<0.001）。過表達PAMM和過表達P

17、AMM C88G均可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6和IL-8的表達（P<0.001）。但與過表達PAMM不同，過表達PAMM C88G未顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達。
　　小結(jié)：①PAMM對巨噬細胞炎性因子的表達具有顯著的抑制作用。②過表達PAMM顯著抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞的ERK1/2，p38MAPK和JNK的磷酸化，提示PAMM抑制LPS刺激的巨噬細胞的MAPK信號通路。③PAMM具有抗氧化應(yīng)激的能力，提示P

18、AMM是一個具有氧化還原功能的調(diào)節(jié)蛋白，它的CXXC結(jié)構(gòu)對其抗氧化的能力是至關(guān)重要；PAMM抑制LPS刺激的巨噬細胞炎性細胞因子生產(chǎn)的能力與其抗氧化性能無關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.PAMM是一個具有CXXC序列的含有類似過氧化物還原酶2結(jié)構(gòu)域的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，是一種新型的脂肪細胞分泌蛋白；
　　2.PAMM抑制 LPS刺激的巨噬細胞炎性因子的表達與其抑制MAPK（ERK、P38MAPK、JNK）的活性有關(guān)，與其抗氧化性