以端粒為靶點的神經氧化損傷的治療新途徑及其作用機制探討.pdf

1、目的：心腦血管意外、膿毒血癥和急性肺損傷等急危重癥，均產生大量活性氧離子（ROS）降低了急救后臟器復蘇的成功率。神經細胞的不可再生性，使缺氧、ROS聚積和氧化應激對其造成不可逆的氧化損傷。因此，腦復蘇是急救領域的治療瓶頸。最新研究發(fā)現，DNA損傷是氧化和抗氧化作用失衡的重要病理生理后果，影響細胞代謝和組織功能。端粒位于真核細胞線狀染色體末端 DNA-蛋白復合體，它與端粒結合蛋白一起構成了特殊的染色體末端“帽子”結構，保持染色體的完整性和

2、抑制DNA損傷。因此，探索以端粒為靶點抑制DNA損傷的抗氧化應激治療可能是提高腦復蘇的新途徑。本文首先證明博來霉素、ICRF-193等介導的氧化應激能直接或間接破壞端粒特異性蛋白TRF2，激活γ-H2AX等DNA損傷信號，提出保護端粒，能降低 DNA損傷和氧化損傷的毒性作用。進而用小鼠神經氧化損傷模型證明TRF2通過維護端粒結構和加強端粒的抗氧化作用，在神經組織中有重要保護作用，闡明其機制與抑制 DNA損傷和消除Aβ和磷酸化 Tau等介

3、導神經氧化損傷的因子有關。
　　方法：基因毒性藥物ICRF-193導致HT1080細胞DNA損傷，細胞轉染技術敲除TRF2表達，免疫熒光檢測細胞 DNA損傷變化。提取野生型小鼠和APPSwe/PS1dE9C57BL/6模型小鼠的腦組織蛋白、DNA、 RNA，利用Western Blot等技術檢測小鼠腦組織及其它組織中TRF2蛋白含量。RT-PCR檢測TRF2在腦組織及其它組織中的表達量。PNA FISH技術分析小鼠腦組織端粒長度變

4、化。左心灌流提取腦組織，免疫熒光染色技術，檢測腦組織和小鼠腦原代神經元TRF2表達情況。檢測神經元中 TRF2蛋白和γH2AX蛋白表達，及神經元形態(tài)變化。在SHSY5Y細胞中，過表達Tau，用免疫熒光，Western Blot等技術,分析P-tau及γH2AX變化。過表達TAU的SHSY5Y細胞通過 siRNA抑制TRF2轉錄表達，檢測 DNA損傷蛋白表達。體外構建 Aβ寡聚體，不同濃度的寡聚體加入敲除或過表達TRF2等不同條件的SHS

5、Y5Y細胞中，檢測DNA損傷蛋白γH2AX及TRF2的表達。
　　結果：⑴TRF2具有保護端粒結構，防止DNA損傷的作用。⑵APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠原代神經元 TRF2表達升高,DNA損傷加重,神經元形態(tài)無明顯改變。⑶Aβ1-42寡聚體引起 SHSY5Y細胞 DNA損傷加重，敲低 TRF2后加重 Aβ1-42寡聚體的對細胞的DNA損傷。⑷過表達TAU的細胞 P-Tau表達上升，DNA損傷加重。⑸過表達TAU的S

6、HSY5Y細胞再敲低TRF2，導致DNA損傷加重。⑹APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠腦TRF2的表達高于野生型小鼠，隨著年齡增長其表達增加。
　　結論：TRF2可以維持端粒的結構，防止基因毒性藥物造成的DNA損傷。TRF2在腦組織高表達，APPSwe/PS1dE9C57BL/6小鼠小鼠中腦組織TRF2相比較于野生型小鼠腦組織表達升高，且隨年齡增加上升，表明TRF2對神經具有保護功能，進一步通過體外構建過表達Tau蛋白的