丹紅注射液抗腦缺血作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　腦卒中，屬于中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇，具有三高（高發(fā)病率、高致殘率、高致死率）特點(diǎn)。根據(jù)病因不同可分為缺血性與出血性，在我國以缺血性腦卒中為主，提高中風(fēng)治療與預(yù)防水平，降低“三高”是其當(dāng)務(wù)之急，也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。缺血性腦卒中病理過程是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制。中醫(yī)認(rèn)為，腦卒中之證有風(fēng)、火、痰、瘀、虛之別，但瘀阻腦絡(luò)是貫穿中風(fēng)病始終的病理核心，故中醫(yī)常用活血化瘀法治療缺

2、血性腦卒中。研究顯示，活血化瘀方可改善缺血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初始即缺血區(qū)的血液供應(yīng)，但在臨床上缺血性腦卒中治療目標(biāo)不僅在于對(duì)缺血區(qū)血液供應(yīng)的改善，同時(shí)也要阻斷腦缺血后“瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)”分子鏈。揭示活血化瘀方在腦缺血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用及抗腦缺血分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，不僅有助于中醫(yī)活血化瘀法科學(xué)內(nèi)涵的闡釋，亦為活血化瘀方在臨床防治腦缺血提供了理論依據(jù)。
　　基于此，本研究以活血化瘀代表方-丹紅方（丹紅注射液）作為切入點(diǎn)，從腦缺血病理反應(yīng)不同環(huán)節(jié)結(jié)

3、合蛋白質(zhì)及代謝組學(xué)技術(shù)，綜合闡釋丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制，以期從分子層面闡釋活血化瘀方防治腦缺血作用機(jī)理。該研究方向獲得了國家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目的資助(No.81330086)，本課題屬于該項(xiàng)目的研究內(nèi)容之一。
　　研究內(nèi)容
　　本研究分為兩個(gè)方面，文獻(xiàn)綜述與實(shí)驗(yàn)研究。
　　文獻(xiàn)綜述:系統(tǒng)回顧了腦缺血病理機(jī)制及與其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并對(duì)丹紅注射液臨床療效、藥理作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了梳理，以期為后期實(shí)驗(yàn)研究提

4、供方向和參考。
　　實(shí)驗(yàn)研究:本研究在對(duì)丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)以及丹紅注射液抗腦缺血“量-效”，“時(shí)-效”研究的基礎(chǔ)上，從腦缺血病理過程中相關(guān)環(huán)節(jié)考察丹紅注射液抗腦缺血的作用，并采用組學(xué)技術(shù)，從蛋白質(zhì)及氨基酸代謝層面，綜合闡釋丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)理，以期為腦缺血現(xiàn)代研究及活血化瘀方防治腦缺血提供深層次認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容共包括三個(gè)部分:
　　1.基于數(shù)據(jù)挖掘的丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)研究:基于《中醫(yī)方劑大辭典》及《中藥成方制劑》

5、數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用“中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)”系統(tǒng)，提取含丹參、紅花藥對(duì)的方劑，運(yùn)用軟件的關(guān)聯(lián)規(guī)則，改進(jìn)的互信息法等數(shù)據(jù)挖掘方法，客觀地分析丹參、紅花藥對(duì)的組方規(guī)律和特點(diǎn)，以期更好地理解丹紅注射液配伍的原理和適應(yīng)證，為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。
　　2.基于腦缺血病理反應(yīng)相關(guān)環(huán)節(jié)的丹紅注射液抗腦缺血作用研究:通過不同劑量丹紅注射液干預(yù)大鼠腦缺血模型，在篩選出最佳劑量的基礎(chǔ)上，觀察丹紅注射液對(duì)12h、24h腦缺血的干預(yù)作用，并從神經(jīng)元凋亡及血

6、腦屏障方面考察丹紅注射液在腦缺血病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)中不同環(huán)節(jié)的保護(hù)作用，從而初步明確丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn)，為后期機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　3.基于組學(xué)技術(shù)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究:在明確丹紅注射液對(duì)腦缺血不同環(huán)節(jié)具有保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，考察丹紅注射液對(duì)腦缺血狀態(tài)下海馬組織中蛋白質(zhì)譜的影響，通過數(shù)據(jù)分析和挖掘，篩選出具有特征變化的相關(guān)蛋白以及這些蛋白可能富集到的通路，并對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證;同時(shí)利用靶標(biāo)代謝

7、組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步考察了其對(duì)腦缺血狀態(tài)下大腦皮層相關(guān)氨基酸代謝變化情況，進(jìn)而從不同層面綜合闡釋丹紅注射液對(duì)腦缺血的保護(hù)作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.基于數(shù)據(jù)挖掘的丹參、紅花藥對(duì)配伍特點(diǎn)研究
　　結(jié)果共納入方劑39首、中成藥74種，其中發(fā)現(xiàn)丹參、紅花常與活血、行氣之品聯(lián)用，且絕大部分藥物歸心、肝經(jīng)，主以胸痹、真心痛、心悸、中風(fēng)、瘀血疼痛證、婦科病等為治療病證。
　　2.基于腦缺血病理反應(yīng)相關(guān)環(huán)節(jié)的丹紅注射液抗腦缺

8、血作用特點(diǎn)研究
　　(1)丹紅注射液抗腦缺血量-效、時(shí)-效研究
　　不同劑量（1.44、0.72、0.36、0.18mL/kg）丹紅注射液干預(yù)腦缺血模型大鼠，以0.72mL/kg效果最佳，且0.72 mL/kg、0.36 mL/kg、0.18 mL/kg劑量之間呈現(xiàn)量效關(guān)系，0.72mL/kg丹紅注射液抗腦缺血作用24h療效優(yōu)于12h。
　　(2)丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠血腦屏障通透性的影響
　　丹紅注射液除可改善

9、腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積外，還可以減輕腦水腫和血腦屏障崩解程度，并對(duì)腦缺血狀態(tài)下腦組織、心肌組織中的α-actinin蛋白含量均有調(diào)整作用，提示α-actinin蛋白變化可能是丹紅注射液治療腦病、心病的共同分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。
　　(3)丹紅注射液對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)凋亡的影響
　　腦缺血后大鼠海馬組織表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞凋亡，缺血誘導(dǎo)了Apaf-1及其下游分子Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)，并且增加Bax表達(dá)

10、，降低Bcl-2的表達(dá)，從而降低Bcl-2/Bax比值;丹紅注射液可顯著抑制Apaf-1及Caspase-9、Caspase-3的激活，逆轉(zhuǎn)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值的變化。提示丹紅注射液可通過抑制腦缺血大鼠海馬組織Apaf-1的表達(dá)，從而抑制Caspase信號(hào)通路活性來發(fā)揮抗凋亡的作用，使Caspase介導(dǎo)的缺血核心周邊半暗帶細(xì)胞凋亡擴(kuò)展減慢。
　　3.基于組學(xué)技術(shù)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究

11、>　　(1)基于靶標(biāo)代謝組學(xué)的丹紅注射液抗腦缺血作用研究
　　研究顯示:腦缺血大鼠供能氨基酸(Val、Ile、Leu、Lys)和神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸(Gln、Glu、Gly、Ser、Tau、Tyr、Phe)變化顯著，丹紅注射液可選擇性調(diào)節(jié)腦中供能氨基酸的異常，降低Glu含量，并抑制Gln、Gly、Ser對(duì)其興奮毒性的放大。提示丹紅注射液可通過改善腦能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸的釋放/合成，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　(2)基于蛋白質(zhì)組

12、學(xué)的丹紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制研究
　　以蛋白質(zhì)組學(xué)為研究手段，發(fā)現(xiàn)與丹紅注射液抗腦缺血作用顯著相關(guān)的蛋白有12個(gè)(Gsk-3β、Cnsk1g1、Gpc4、Ctbp2、Acta2、Apc、Akt1、Sos1、Prkaa1、Eef2、Flnc、Rap1a)，主要富集于WNT信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路，并對(duì)其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析，獲得以Gsk-3β和Akt1為中心節(jié)點(diǎn)的與其它潛在靶標(biāo)蛋白共同組成的蛋白網(wǎng)絡(luò)

13、，結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除Ctbp2外其余11個(gè)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致，且Gsk-3β蛋白抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了丹紅注射液參與了候選蛋白質(zhì)在腦缺血損傷海馬組織中的表達(dá)變化。
　　綜上所述，通過本研究初步揭示了丹紅注射液抗腦缺血的作用特點(diǎn)、蛋白網(wǎng)絡(luò)、相關(guān)信號(hào)通路以及氨基酸代謝情況，從而系統(tǒng)闡釋活血化瘀方（丹紅注射液）抗腦缺血的作用及其機(jī)制;另外，所獲得的蛋白網(wǎng)絡(luò)可能是腦缺血病理機(jī)制的核心單元，進(jìn)而為認(rèn)識(shí)和防治腦缺血提供參