乙酰谷酰胺及谷紅注射液抗腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血是導(dǎo)致人類(lèi)殘疾與死亡的重要疾病之一，給患者的生活造成了極大的影響。目前臨床上腦缺血治療的方案之一是聯(lián)合使用溶栓藥物與神經(jīng)保護(hù)藥物。但如何減少經(jīng)溶栓處理后的再灌注損傷已經(jīng)成為一個(gè)重要問(wèn)題。到目前為止，尚缺乏療效確切且能夠?qū)鼓X缺血再灌注損傷的藥物。
　　乙酰谷酰胺注射液是臨床上廣泛應(yīng)用的腦功能改善輔助劑，其治療腦血管疾病的有效性得到了一系列臨床試驗(yàn)的證實(shí)，但迄今為止對(duì)乙酰谷酰胺的腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚缺乏深入探討，因此，本研

2、究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，在整體水平上觀察乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的有效性，并從細(xì)胞水平、分子水平等多層面探討乙酰谷酰胺的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更全面的理論基礎(chǔ)，為抗腦缺血的新藥研發(fā)提供新思路。
　　谷紅注射液為乙酰谷酰胺和中藥紅花提取物制成的復(fù)方制劑，臨床試驗(yàn)研究證實(shí)谷紅注射液可以減輕急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損程度，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但由于谷紅注射液的成分較復(fù)雜，目前其作

3、用機(jī)制尚不清楚。本研究在明確谷紅注射液具有抗腦缺血再灌注損傷作用的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)，對(duì)谷紅注射液的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　第一部分、乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的藥效學(xué)研究
　　1.建立大鼠MCAO模型，模型組大鼠體重顯著減輕(P＜0.05)，神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分顯著增加（P＜0.001），雙側(cè)前肢完全去除貼紙的時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.001），經(jīng)過(guò)乙酰谷酰胺的治療14d可顯著增加大鼠的體重，減少神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分并且

4、可以顯著縮短雙側(cè)前肢完全去除貼紙的時(shí)間(P＜0.05)。
　　2.乙酰谷酰胺治療14d后，進(jìn)行平衡桿實(shí)驗(yàn)，MCAO模型組大鼠過(guò)桿時(shí)間較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）。而經(jīng)乙酰谷酰胺治療后大鼠過(guò)桿總時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），并且具有較好的劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　3.Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:乙酰谷酰胺能顯著改善缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降，提高大鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的正確率(P＜0.05)。存自發(fā)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，乙酰谷酰胺對(duì)

5、缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的精神異常有一定的改善作用。
　　4.TTC染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示缺血再灌第14d，MCAO模型組大鼠腦梗死體積顯著增加(P＜0.01)，經(jīng)過(guò)乙酰谷酰胺治療可以顯著減少腦梗死體積(P＜0.05)。
　　第二部分、乙酰谷酰胺抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究
　　1.TH免疫組化染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO模型大鼠黑質(zhì)致密區(qū)內(nèi)單位面積TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目以及紋狀體TH陽(yáng)性神經(jīng)纖維的累計(jì)光密度值(IOD)均顯著

6、降低(P＜0.01)，而乙酰谷酰胺各劑量組單位面積TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較模型組均顯著增加，TH陽(yáng)性纖維的IOD值亦顯著增加(P＜0.01)，提示乙酰谷酰胺能明顯改善腦缺血再灌注誘導(dǎo)的黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷。
　　2.模型組大鼠黑質(zhì)致密區(qū)內(nèi)單位面積Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），形態(tài)上由橢圓形、胞體小、突起多的靜止型小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸變化為圓形、胞體大、突起少的活化型小膠質(zhì)細(xì)胞；乙酰谷酰胺各劑量組單位面積Iba-

7、1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較模型組均顯著降低（P＜0.01），形態(tài)上亦有差異。
　　3.中腦黑質(zhì)區(qū)TUNEL染色結(jié)果表明，模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)內(nèi)單位面積TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比率較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）而乙酰谷酰胺治療14 d后，中、高劑量組單位面積TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比率較模型組均顯著降低(P＜0.01)。
　　4.中腦組織蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠前凋亡誘導(dǎo)因子TARF1的表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高，磷酸化Akt以及Bcl

8、-2/Bax的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；而乙酰谷酰胺治療14 d后， TRAF1表達(dá)水平較模型組顯著降低，磷酸化Akt以及Bcl-2/Bax的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)。
　　5.皮層區(qū)CD31免疫熒光染色以及VEGF蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，模型組大鼠皮層區(qū)微血管數(shù)目較假手術(shù)組顯著增多（P＜0.05），微血管走形紊亂呈迂曲的不規(guī)則形狀。與模型組比較，乙酰谷酰胺三個(gè)劑量組的血管密度較模型組也顯著升高(P＜0.05)，微血

9、管分支數(shù)目增多。血管內(nèi)皮細(xì)胞因子VEGF的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低，給予不同劑量的乙酰谷酰胺均可以提高VEGF的蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　6.SVZ區(qū)Nestin染色結(jié)果顯示:模型組大鼠Nestin陽(yáng)性表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高，而乙酰谷酰胺中、高劑量組的Nestin陽(yáng)性表達(dá)較模型組也顯著升高，并有向梗死灶紋狀體區(qū)域遷移的趨勢(shì)。
　　7.1μM和10μM濃度的乙酰谷酰胺對(duì)于Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作

10、用，表現(xiàn)為與模型組相比，細(xì)胞活性顯著升高(P＜0.05)。10μM的乙酰谷酰胺可以顯著抑制Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。
　　8.研究發(fā)現(xiàn)Na2S2O4可造成PC12細(xì)胞和中腦原代神經(jīng)元的線粒體膜電位顯著下降，而乙酰谷酰胺可以明顯改善Na2S2O4對(duì)PC12細(xì)胞和中腦原代神經(jīng)元的線粒體膜電位的變化(P＜0.05)。
　　9.體外實(shí)驗(yàn)中，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，Na2S2O4損傷的PC12細(xì)胞前凋亡誘導(dǎo)因子TRAF1的表

11、達(dá)水平逐漸升高；10μM濃度乙酰谷酰胺治療后， TRAF1的表達(dá)較模型組減少(P＜0.05)同時(shí)能夠促進(jìn)凋亡通路中的上游蛋白激酶Akt磷酸化(P＜0.01)，提高Bcl-2/Bax的比值（P＜0.05），最終抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　10.TRAF1/DAPI雙染的免疫熒光結(jié)果顯示，在Na2S2O4損傷PC12細(xì)胞中，TRAF1綠色熒光表達(dá)水平升高，主要在胞漿中表達(dá)；而與模型組比較，10μM濃度的乙酰谷酰胺治療后，發(fā)現(xiàn)TRAF

12、1的綠色熒光表達(dá)下降，這與WB的結(jié)果相符。
　　11.Na2S2O4損傷的PC12細(xì)胞中總谷胱甘肽(GSH)含量降低（P＜0.01），而10μM濃度的乙酰谷酰胺可以顯著提高PC12細(xì)胞中GSH的表達(dá)(P＜0.05)。
　　第三部分、基于基因芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)谷紅注射液抗腦缺血作用機(jī)制初探
　　1.谷紅注射液可以顯著改善MCAO模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙；TH免疫組化結(jié)果顯示，谷紅注射液對(duì)黑質(zhì)致密區(qū)TH陽(yáng)性細(xì)胞有保護(hù)作用。

13、>　　2.與假手術(shù)組相比， MCAO模型組大鼠的紋狀體的全基因表達(dá)譜芯片共篩選出顯著差異表達(dá)基因共1303個(gè)，其中上調(diào)的基因985個(gè)，下調(diào)的基因318個(gè)。經(jīng)過(guò)14d給藥治療，與模型組比較，谷紅注射液組有812個(gè)基因發(fā)生顯著改變，其中上調(diào)的基因234個(gè)，下調(diào)的基因578個(gè)。
　　3.通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行的GO分析提示這些基因涉及受體活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程、系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、細(xì)胞分子代謝過(guò)程、受體活性、細(xì)胞受