RhoA-ROCK信號通路在青霉素和雙黃連注射液類過敏反應中的作用研究.pdf

1、目的
　　研究兩種代表性注射劑青霉素注射液和雙黃連注射液的過敏樣反應特點，探討其導致血管內(nèi)皮通透性增加的機理，闡明RhoA/ROCK信號通路在青霉素和雙黃連注射液致類過敏反應中所起到的作用。此外，明確雙黃連注射液導致類過敏反應的主要成分。
　　方法
　　1、青霉素注射液過敏樣反應特點
　　(1) ICR小鼠腹腔注射6.25、25或100萬單位·kg-1青霉素鈉（氫氧化鋁為佐劑）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏

2、小鼠和未致敏小鼠分別一次性尾靜脈注射3.125、12.5或50萬單位·kg-1青霉素鈉和伊文思藍(EB)的混合液。給藥30min后，以小鼠耳廓藍染面積評分和耳組織EB滲出量為指標，分別觀察青霉素注射液引起小鼠過敏反應和類過敏反應的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射青霉素鈉致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。將血清注射到空白小鼠背部皮膚使其被動致敏，2h后對小鼠一次性尾靜脈注射3.125、12.5或50萬單位·kg-1青霉

3、素鈉和EB的混合液。30min后，觀察接受血清小鼠皮膚內(nèi)側(cè)藍斑情況。
　　(3) ICR小鼠一次性尾靜脈注射12.5、25或50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥30min后處死動物，用打耳器打下耳片稱重，同時取耳和肺組織進行病理學檢查。
　　2、雙黃連注射液過敏樣反應特點
　　(1) ICR小鼠腹腔注射300mg·kg-1雙黃連（氫氧化鋁為佐劑）致敏3次（隔日1次），14天后，致敏小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1

4、雙黃連和EB的混合液。給藥30min后，以小鼠耳廓藍染面積評分和耳組織EB滲出量為指標，分別觀察雙黃連注射液引起小鼠過敏反應和類過敏反應的可能性。
　　(2) ICR小鼠腹腔注射雙黃連注射液致敏（方法同前），14天后采集致敏血清。將血清注射到空白小鼠背部皮膚使其被動致敏，2h后對小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液。給藥30min后，觀察接受血清小鼠皮膚內(nèi)側(cè)藍斑情況。
　　(3) ICR小鼠一次性尾靜

5、脈注射150、300或600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液，給藥30min后對小鼠耳廓藍染面積進行評分，用打耳器打下耳片稱重，定量測定耳組織EB滲出量，并取耳、肺、腸組織進行病理學檢查。
　　3、青霉素注射液類過敏反應的產(chǎn)生機制
　　(1)對血管內(nèi)皮細胞單層通透性的影響:采用Transwell小室將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)培養(yǎng)成體外血管內(nèi)皮細胞單層，加入0.125、0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液與血管內(nèi)皮

6、細胞單層孵育1h后，檢測FITC-葡聚糖透過細胞單層的情況。
　　(2)對血管內(nèi)皮細胞骨架的影響:采用細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)HUVECs，加入0.125、0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液孵育1h，用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對細胞F-actin染色，觀察細胞骨架的變化。
　　(3)對RhoA/ROCK信號通路的影響:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.5萬單位·mL-1青霉素注射液孵育5、15、30、60min，收集細胞。采用Wes

7、tern-blot方法檢測細胞GTP-RhoA（GTP-RhoA/RhoA％）、p-MYPT1(p-MYPT1/MYPT1％)和p-MLC2(p-MLC2/MLC2％)蛋白的表達。另外，小鼠一次性尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥15、30、60、120min后取耳和肺組織，采用Western-blot方法檢測組織中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達。
　　(4) ROCK抑制劑對青霉素注射液作用的

8、影響:在培養(yǎng)的HUVECs或細胞單層中加入鹽酸法舒地爾預先處理后，加入青霉素注射液，按照上述同樣方法檢測p-MYPT1和p-MLC2表達變化、血管內(nèi)皮細胞骨架變化以及細胞單層FITC-葡聚糖透過情況。此外，小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素鈉，給藥后15min和30min分別取耳和肺組織檢測p-MYPT1和p-MLC2表達變化情況。小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射50萬單位·kg-1青霉素

9、鈉和EB的混合液，30min后進行耳廓藍染面積、耳組織EB滲出量、耳片重量、耳和肺組織病理學等檢查。
　　4、雙黃連注射液類過敏反應的產(chǎn)生機制
　　(1)對血管內(nèi)皮細胞單層通透性的影響:采用Transwell小室培養(yǎng)體外血管內(nèi)皮細胞單層，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液與血管內(nèi)皮細胞單層孵育1h后，檢測FITC-葡聚糖透過細胞單層的情況。
　　(2)對血管內(nèi)皮細胞骨架的影響:采用細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)H

10、UVECs，加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液孵育1h，用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對細胞F-actin染色，觀察細胞骨架的變化。
　　(3)對RhoA/ROCK信號通路的影響:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.15mg·mL-1雙黃連注射液孵育15、30、60、120min，收集細胞。采用Western-blot方法檢測細胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達。另外，小鼠一次性尾靜脈注射60

11、0mg·kg-1雙黃連注射液，給藥15、30、60、120min后取耳、肺和腸組織，采用Westem-blot方法檢測組織中GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達。
　　(4) ROCK抑制劑對雙黃連注射液作用的影響:在培養(yǎng)的HUVECs或細胞單層中加入鹽酸法舒地爾預先處理后，加入雙黃連注射液，按照上述同樣方法檢測p-MYPT1和p-MLC2表達變化、血管內(nèi)皮細胞骨架變化、以及細胞單層FITC-葡聚糖透過情況。此

12、外，小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連，給藥后30min分別取耳、肺和腸組織檢測p-MYPT1和p-MLC2表達變化情況。小鼠腹腔注射給予法舒地爾3次后，經(jīng)尾靜脈注射600mg·kg-1雙黃連和EB的混合液，30min后進行耳廓藍染面積、耳組織EB滲出量、耳片重量、耳、肺和腸組織病理學等檢查。
　　5連翹酯苷類成分的類過敏反應及其致類過敏機制研究
　　(1)類過敏反應研究:采用Transw

13、ell小室培養(yǎng)體外血管內(nèi)皮細胞單層，分別加入0.05、0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A、B或E孵育1h后，檢測FITC-葡聚糖透過細胞單層的情況。采用細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)HUVECs，加入上述濃度的連翹酯苷A、B或E孵育1h，用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對細胞F-actin染色，觀察其對血管內(nèi)皮細胞骨架的影響。另外，小鼠一次性尾靜脈注射600mg·kg-1連翹酯苷A、B或E，給藥30min后觀察耳廓藍染面積，定量測定耳組織EB滲出量，以評價

14、體內(nèi)類過敏反應。
　　(2)類過敏機制研究:采用培養(yǎng)皿培養(yǎng)HUVECs，加入0.05、0.1或0.15 mg·mL-1連翹酯苷A、B或E，收集細胞。采用Western-blot方法檢測細胞GTP-RhoA、p-MYPT1、p-MLC2蛋白的表達。在培養(yǎng)的HUVECs或細胞單層中加入鹽酸法舒地爾預先處理后，加入連翹酯苷A或B，按照上述同樣方法檢測p-MYPT1和p-MLC2表達變化、血管內(nèi)皮細胞骨架變化、以及細胞單層FITC-葡聚糖

15、透過情況。
　　結(jié)果
　　1、青霉素注射液致小鼠類過敏反應
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在靜脈注射給予青霉素鈉后，均出現(xiàn)類似的耳藍染反應，這種反應與青霉素劑量成正相關，與致敏無關。PCA試驗顯示青霉素注射液不能誘導IgE產(chǎn)生，因此青霉素注射液誘導的上述反應不是IgE介導的，可能是類過敏反應。組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，青霉素鈉單次靜脈注射后，小鼠的耳和肺組織出現(xiàn)劑量相關的水腫和炎癥反應，提示青霉素注射液可導致小鼠產(chǎn)生以血管滲出增加

16、和炎癥反應為特征的類過敏反應。
　　2、雙黃連注射液致小鼠類過敏反應
　　致敏小鼠和未致敏小鼠在靜脈注射給予雙黃連后，均出現(xiàn)類似的耳藍染反應，這種反應與致敏無關。PCA試驗顯示雙黃連注射液不能誘導IgE產(chǎn)生，因此雙黃連注射液誘導的上述反應不是IgE介導的，可能是類過敏反應。此外，雙黃連注射液所導致的耳藍染反應與給藥劑量正相關。組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，雙黃連單次靜脈注射后，小鼠的耳、肺和腸組織出現(xiàn)劑量相關的水腫和炎癥反應。結(jié)果提示

17、，雙黃連注射液可導致小鼠產(chǎn)生以血管滲出增加和炎癥反應為特征的類過敏反應。
　　3、RhoA/ROCK信號通路參與青霉素注射液的類過敏反應
　　在體外試驗中，0.5或2萬單位·mL-1青霉素注射液可導致HUVECs肌動蛋白明顯聚集和重組以及血管內(nèi)皮細胞單層通透性顯著增加，反應與濃度相關。0.5萬單位·mL-1青霉素注射液可導致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2表達增加，以加藥后15-30min作用最為

18、明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢。采用法舒地爾預處理可以明顯改善青霉素注射液誘導的血管內(nèi)皮細胞單層通透性增加和細胞骨架變化。在體內(nèi)試驗中，小鼠一次性尾靜脈注射給予50萬單位·kg-1青霉素鈉會導致耳和肺組織GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達增加，蛋白上調(diào)一般在給藥后15-30min最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢。預先給予法舒地爾可以抑制青霉素注射液所引發(fā)的血管滲出增加和炎癥反應。結(jié)果提示，RhoA/ROCK信號通路激活是誘導青霉

19、素注射液類過敏反應的重要機制之一。
　　4、RhoA/ROCK信號通路參與雙黃連注射液的類過敏反應
　　在體外試驗中，0.1或0.15mg·mL-1雙黃連注射液可導致HUVECs肌動蛋白聚集和重組以及血管內(nèi)皮細胞單層通透性增加，反應與濃度有一定相關性。0.15mg·mL-1雙黃連注射液可導致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達增加，以加藥后15-30 min作用最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢。采用

20、法舒地爾預處理可以改善雙黃連注射液誘導的血管內(nèi)皮細胞單層通透性增加和細胞骨架變化。在體內(nèi)試驗中，小鼠一次性尾靜脈注射給予600mg·kg-1雙黃連會導致耳、肺、腸組織GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2的表達增加，蛋白上調(diào)一般在給藥后15-60min最為明顯，之后出現(xiàn)下降的趨勢。預先給予法舒地爾可以抑制雙黃連注射液所引發(fā)的血管滲出增加和炎癥反應。結(jié)果提示，RhoA/ROCK信號通路激活是誘導雙黃連注射液類過敏反應的重要機制之一

21、。
　　5、RhoA/ROCK信號通路參與連翹酯苷的類過敏反應
　　在體外試驗中，0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A和連翹酯苷B可導致HUVECs單層通透性明顯增加，而連翹酯苷E對細胞單層通透性影響較小。與通透性結(jié)果一致，0.1或0.15mg·mL-1連翹酯苷A和連翹酯苷B可誘導HUVECs細胞骨架變化，而連翹酯苷E的作用相對較弱。連翹酯苷A和連翹酯苷B可導致HUVECs GTP-RhoA、p-MYPT1和p-MLC2

22、的表達呈濃度相關性增加，其中連翹酯苷A的作用強于連翹酯苷B，而連翹酯苷E則對蛋白的表達幾乎沒有影響。給予法舒地爾可以明顯抑制連翹酯苷A和連翹酯苷B誘導的血管內(nèi)皮細胞單層通透性增加和細胞骨架變化。通過體內(nèi)試驗驗證發(fā)現(xiàn)，連翹酯苷A和連翹酯苷B可引起小鼠血管滲出增加，而連翹酯苷E則未見該作用。結(jié)果提示，連翹酯苷通過激活RhoA/ROCK信號通路誘發(fā)動物類過敏反應的作用與化合物的化學結(jié)構(gòu)有關。
　　結(jié)論
　　1、青霉素和雙黃連注射液

23、均可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)以血管滲出增加和炎癥反應為特征的類過敏反應;未誘導IgE介導的過敏反應。二者所致的類過敏反應均具有劑量相關性，提示臨床上控制劑量可能降低該不良反應。
　　2、RhoA/ROCK信號通路激活，從而產(chǎn)生血管內(nèi)皮細胞骨架調(diào)整，致使血管通透性增高，是青霉素和雙黃連注射液類過敏反應的重要機制之一。
　　3、連翹酯苷類成分是雙黃連注射液的主要致類過敏成分之一，但不同的連翹酯苷引起的反應強度差別較大。其中，連翹酯苷A誘發(fā)的