人參皂苷Rg1抑制原代中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制探討.pdf

1、星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、體積最大的膠質(zhì)細(xì)胞，不僅是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本骨架，而且是其正常功能的重要參與者。大量研究顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)退行性疾病，如帕金森?。≒arkinson's Disease, PD）的病理過(guò)程。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠釋放一系列的炎癥因子、活性氧和活性氮等，從而發(fā)揮其神經(jīng)損傷作用。
　　人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）是傳統(tǒng)中藥人參的主要活性成分，離體細(xì)胞和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2、均證實(shí)Rg1具有抗炎作用，但是Rg1通過(guò)何種機(jī)制作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，目前尚不清楚。Rg1具有甾體結(jié)構(gòu)骨架，本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)Rg1具有類雌激素樣和類糖皮質(zhì)激素樣作用，可以作為糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor, GR）的功能性配體，對(duì)抗神經(jīng)毒素對(duì)神經(jīng)元的損傷。GR是轉(zhuǎn)錄因子核激素受體超家族中的一員，通過(guò)與糖皮質(zhì)激素結(jié)合控制多個(gè)細(xì)胞事件。有研究顯示，GR參與星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性損傷及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的

3、發(fā)展。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor, GPER）是一種新型的膜性雌激素受體，雌激素可以通過(guò)GPER介導(dǎo)的快速非基因組機(jī)制，發(fā)揮抗炎和抗凋亡等作用。本課題組前期的工作證實(shí)Rg1是一種新的植物雌激素，可通過(guò)非配體依賴的方式激活雌激素受體（estrogen receptor, ER），那么Rg1能否通過(guò)GR和GPER抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)？目前研究較少。本研究在脂多糖（lip

4、opolysaccharide, LPS）制備的大鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型上，采用MTT、免疫細(xì)胞熒光、real time PCR和western blot技術(shù)方法，應(yīng)用GR的特異性阻斷劑RU486或GPER的特異性阻斷劑G15與Rg1共同作用，探討Rg1的抗炎作用及其分子機(jī)制。此外，本研究應(yīng)用Rg1單獨(dú)作用星形膠質(zhì)細(xì)胞，探討了其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及其分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.人參皂苷Rg1抑制LPS誘導(dǎo)的星

5、形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　（1）原代培養(yǎng)中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法，檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表達(dá)，結(jié)果顯示95%以上為星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　（2）單用LPS（1μg/mL）或不同濃度Rg1（0.1,1,10和20μM）處理星形膠質(zhì)細(xì)胞24h，MTT結(jié)果顯示，其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響（P＞0.05）。

6、r>　?。?）LPS能明顯增加星形膠質(zhì)細(xì)胞TNFα、IL-1β和iNOS mRNA的表達(dá)（P＜0.001）， 不同濃度Rg1（0.1,1,10和20μM）能夠劑量依賴式的抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其中20μM Rg1作用最明顯（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），我們選用20μM的Rg1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　?。?）GR阻斷劑RU486（1μM）不能阻斷Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS

7、mRNA表達(dá)的抑制作用（P＞0.05）。
　?。?）RU486能夠阻斷Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子限速酶COX2和iNOS蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.01，P＜0.001）。
　　（6）GPER阻斷劑G15（1μM）能夠阻斷Rg1對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS mRNA表達(dá)的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　　（7）GPER特異性激動(dòng)劑G1（1μM）能夠明顯抑制LPS誘

8、導(dǎo)的TNFα、IL-1β、COX2和iNOS mRNA的表達(dá)（P＜0.01, P＜0.001）。 G15不能阻斷G1在mRNA水平對(duì)TNFα、IL-1β和COX2表達(dá)的抑制的作用（P＞0.05），但可以阻斷iNOS的基因表達(dá)（P＜0.05）。
　?。?）G15能夠阻斷Rg1和G1對(duì)LPS誘導(dǎo)的COX2和iNOS的蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。
　　2.人參皂苷Rg1促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)研究
　?。?）R

9、g1單獨(dú)作用星形膠質(zhì)細(xì)胞6,12,24和48h，可以時(shí)間依賴性調(diào)控GFAP、GDNF及c-fos mRNA的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　?。?）應(yīng)用GPER阻斷劑G15，可以阻斷Rg1在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)GFAP、GDNF及c-fos mRNA表達(dá)的調(diào)控（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。
　?。?）Rg1單獨(dú)作用星形膠質(zhì)細(xì)胞30min，可以明顯增加ERK、CREB蛋白的磷酸化水平（P＜0.