FKBP5基因突變?cè)趐aget骨病發(fā)病中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、Paget骨病(Paget'sdiseaseofbone，PDB)是一種慢性代謝性骨疾病，由異常的溶骨性病變繼發(fā)過(guò)度的成骨性硬化而導(dǎo)致，常累及骨骼系統(tǒng)中的任意單個(gè)或者多個(gè)部位。PDB發(fā)病率具有顯著地域差異，其在歐美一些西方國(guó)家發(fā)病率較高，是僅次于骨質(zhì)疏松的第二大代謝性骨病。然而在非洲和亞洲國(guó)家PDB卻較為罕見(jiàn)，其中我國(guó)自上世紀(jì)八十年代起已報(bào)道的PDB病例僅有約200余例。PDB臨床癥狀常不典型，病情輕重不一。約22％的PDB患者無(wú)任何臨

2、床表現(xiàn)，僅僅在進(jìn)行骨骼放射性檢查時(shí)偶然檢出患有Paget骨病。PDB常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)主要包括骨痛以及骨骼畸形，并可能伴隨一系列的并發(fā)癥，包括椎管狹窄、耳鳴、耳聾、視力下降等神經(jīng)壓迫癥狀、繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎以及骨折等，極少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥一骨肉瘤。
　　破骨細(xì)胞異?；罨荘DB主要的病理改變。病理檢查可見(jiàn)患者受累骨骼處的破骨細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大且含有較多胞核。PDB患者外周血單核細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子的敏感性增高，使得破骨細(xì)胞分

3、化增多。PDB病理發(fā)展過(guò)程可大體分為三個(gè)時(shí)期:首先，破骨細(xì)胞異?；罨瘜?dǎo)致溶骨增加，形成早期的溶骨期;第二，溶骨性病變繼發(fā)成骨細(xì)胞活化，形成過(guò)度溶骨與成骨紊亂混合存在的混合期;最后，過(guò)度而無(wú)序的代償性成骨增多形成骨硬化期。三期改變依次發(fā)生，最終導(dǎo)致患者骨骼結(jié)構(gòu)紊亂、膨大畸形。
　　PDB具體的發(fā)病原因至今仍不清楚，一般認(rèn)為遺傳因素和環(huán)境因素在PDB發(fā)病過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。以往有研究認(rèn)為，在PDB溶骨性病變部位的破骨細(xì)胞內(nèi)存在麻疹病

4、毒、呼吸道合胞病毒感染所形成的病毒小體，從而支持病毒感染導(dǎo)致PDB發(fā)病的結(jié)論。然而，關(guān)于這一類(lèi)病毒小體的特異性仍存在較多爭(zhēng)論，有研究者證實(shí)在遺傳性草酸過(guò)多癥和骨硬化癥患者體內(nèi)的破骨細(xì)胞中同樣能檢出這種病毒小體，同時(shí)許多研究者表示未能在PDB患者體內(nèi)的破骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)病毒感染的證據(jù)，提示病毒感染導(dǎo)致PDB發(fā)病的結(jié)論仍存有異議。遺傳因素在PDB發(fā)病過(guò)程中具有重要的致病作用，迄今為止，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析以及候選位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，已經(jīng)確認(rèn)了7個(gè)PD

5、B易感基因位點(diǎn)(PDB1-7)，提示PDB發(fā)病具有典型的遺傳異質(zhì)性。位于PDB3(5q35)的SQSTM1基因是目前唯一確認(rèn)的PDB致病基因。流行病學(xué)研究表明約10-50％的家族性PDB患者以及5-30％散發(fā)性PDB患者存在SQSTM1基因突變。另外，烈FSF11A、TNFRSF11B以及VCP基因，因其所編碼的蛋白在破骨細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用，以及他們?cè)谝恍㏄DB相關(guān)疾病中的致病作用，也被列為PDB候選致病基因而廣泛關(guān)注。其中，位

6、于TNFRSF11A基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP):rs1805034與PDB易感性相關(guān)，但尚無(wú)證據(jù)能夠證實(shí)該SNP是PDB的致病基因多態(tài)性。TNFRSF11B基因突變與早發(fā)性PDB(juvenilePDB)患者發(fā)病相關(guān)，VCP基因突變報(bào)道見(jiàn)于包涵體肌病伴Paget骨病和額顳葉癡呆，但在PDB患者中尚沒(méi)有關(guān)于這兩個(gè)基因突變的報(bào)道。
　　本研究當(dāng)中，我們報(bào)道了一個(gè)來(lái)自中國(guó)漢族人群的PDB家系，并對(duì)該家系中可能存在的PDB致病基因突變

7、及其致病機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。課題從PDB致病基因檢測(cè)、功能驗(yàn)證和機(jī)制研究三個(gè)方面，系統(tǒng)的證實(shí)了一個(gè)位于FKBP5基因的c.163G＞C突變是PDB的致病基因突變。通過(guò)本文的論述，我們旨在提高該罕見(jiàn)疾病在國(guó)內(nèi)的認(rèn)知度，減少PDB在國(guó)內(nèi)的漏診誤診率;探索該疾病的致病基因及其致病機(jī)制，為PDB病因?qū)W的研究提供數(shù)據(jù)支持以及新的研究方向。
　　第一部分Paget骨病家系基因突變檢測(cè)分析
　　目的報(bào)道一例漢族家族性Paget骨病，并對(duì)

8、該家系成員進(jìn)行基因突變檢測(cè)分析，尋找PDB相關(guān)基因突變。
　　方法1.Paget骨病診斷根據(jù)患者典型的影像學(xué)檢查結(jié)果、血清學(xué)檢查結(jié)果及臨床表現(xiàn)，診斷并報(bào)道一例家族性Paget骨病。2.PDB已知致病及相關(guān)基因測(cè)序分析對(duì)家系成員DNA樣本進(jìn)行已知PDB易感基因（SQSTM1、NFRSF11A）外顯子測(cè)序分析，尋找基因突變。3.外顯子組測(cè)序分析對(duì)家系中三位PDB患者的DNA樣本，以及患者的兩位同胞兄妹的DNA樣本，進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分

9、析(wholeexomesequencing，WES)，并對(duì)WES分析得到的所有單核苷酸改變(SingleNucleotideVariants，SNVs)按照下列條件篩選出與疾病共分離的基因突變:1.不存在于已知的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(dBSNP)中;2.同時(shí)存在于三位患者的基因組內(nèi);3.不存在于兩位正常對(duì)照成員的基因組內(nèi);4.位于基因編碼區(qū);5.引起基因編碼錯(cuò)誤。4.候選基因分析在ExomeAggregationConsortium(

10、ExAC)數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，排除已知基因突變。通過(guò)運(yùn)用PolyPhen-2軟件預(yù)測(cè)突變功能，選取預(yù)測(cè)結(jié)果顯示突變對(duì)蛋白功能有害的基因突變。綜合以上分析結(jié)果，選擇候選基因突變。5.FKBP5基因突變測(cè)序驗(yàn)證采用Sanger測(cè)序法，對(duì)所有家系成員以及200例正常對(duì)照的FKBP5第4外顯子（FKBP5基因c.163G＞C突變所在位點(diǎn)）進(jìn)行測(cè)序分析。從而驗(yàn)證該突變?cè)诩蚁抵械姆植记闆r以及驗(yàn)證該突變是否為未經(jīng)報(bào)道的SNP。
　　結(jié)果1.Paget

11、骨病家系臨床資料本研究報(bào)道了一例發(fā)生于中國(guó)漢族人群的典型的家族性Paget骨病。家系中現(xiàn)存3名Paget骨病患者?；颊呤芾酃趋繶射線檢查結(jié)果符合典型的Paget骨病改變，包括骨皮質(zhì)膨大增厚、骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂、受累顱骨呈現(xiàn)棉絮樣改變等;病變累及部位主要包括:顱骨、椎骨及骨盆;患者臨床表現(xiàn)主要包括骨痛、脊柱畸形、頸椎及四肢乏力、身高縮短及病理性髕骨骨折等;血清學(xué)檢查結(jié)果顯示患者堿性磷酸酶(ALP)活性顯著升高。在疾病得到診斷(2011)到患者

12、接受藥物治療(2014)的三年中，家系中三名患者病情及血清ALP水平隨時(shí)間增加而進(jìn)行性加重。2014年，患者接受密固達(dá)靜脈注射治療后病情得到有效控制。2.該P(yáng)DB家系中未檢測(cè)到SQSTM1及TNFRSF11A基因突變除多個(gè)SNP位點(diǎn)外，在患者及其他家系成員中，未檢測(cè)到SQSTM1及TNFRSF11A基因突變。提示可能存在新的基因突變參與PDB發(fā)病。3.外顯子測(cè)序分析結(jié)果顯示一個(gè)新的FKBP5基因突變與PDB發(fā)病相關(guān)外顯子組測(cè)序分析結(jié)果顯

13、示5個(gè)位于不同基因的錯(cuò)意單核苷酸突變，包括:FKBP5(c.163G＞C)、ACBD4(c.4G＞T)、MY07B(c.772A＞T)、AKNA(c.4196A＞G)、CCL4L1(c.197G＞C)可能與PDB發(fā)病相關(guān)。其中位于ACBD4、MY07B及CCL4L1的基因突變?cè)贓xAC數(shù)據(jù)庫(kù)中已有報(bào)道，而位于FKBP5以及AKNA基因的突變?cè)贓xAC數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道。PolyPhen-2預(yù)測(cè)結(jié)果顯示FKBP5(c.163G＞C)基因突變

14、極有可能損害蛋白功能(possiblepathogenicityscore:0.992)，而AKNA(c.4196A＞G)基因突變極有可能為良性突變，不影響蛋白功能(possiblepathogenicityscore:0.080)。另外，F(xiàn)KBP5基因位于一個(gè)已知的PDB易感位點(diǎn)(PDB1)內(nèi)，且根據(jù)以往文獻(xiàn)的報(bào)道FKBP5編碼的FKBP5蛋白在兩條破骨細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路:NF-κB以及AKT信號(hào)通路中具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此

15、，確認(rèn)該FKBP5基因突變可能與PDB發(fā)病相關(guān)，并選擇該突變?yōu)镻DB候選致病基因突變。4.FKBP5突變驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果確認(rèn)家系中所有患者的FKBP5基因均存在c.163G＞C點(diǎn)突變，表型為GC雜合子。家系中有5位患者的后代(Ⅲ3，Ⅲ13，Ⅲ15，Ⅲ17，Ⅳ2)攜帶有該基因突變。同時(shí)，在200例對(duì)照人群中未檢出該基因突變，證實(shí)該基因變異是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的單核苷酸突變而非未經(jīng)報(bào)道過(guò)的SNP。
　　結(jié)論本研究報(bào)道了一例發(fā)生在中國(guó)漢族人群中的罕

16、見(jiàn)家族性Paget's骨病。通過(guò)對(duì)家系成員進(jìn)行基因檢測(cè)分析，確認(rèn)該家系中不存在已知的PDB易感基因突變。外顯子組測(cè)序分析確認(rèn)一個(gè)新的位于FKBP5基因的c.163G＞C突變?yōu)镻DB候選致病基因突變。
　　第二部分FKBP5V55L對(duì)NF-κB和Akt信號(hào)通路的影響
　　目的預(yù)測(cè)突變體FKBP5V55L三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比較野生型和突變型FKBP5在NF-κB以及Akt信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)作用。
　　方法1.FKBP5

17、V55L突變體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用Pymol軟件對(duì)FKBP5V55L突變體蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。2.NF-κB信號(hào)通路研究a.將構(gòu)建有野生型及突變型FKBPcDNA的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒及空載對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1)、PGL4.32[luc2p/NF-κB-RE/Hygro]質(zhì)粒以及PRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性(lu

18、ciferaseassay)反應(yīng)NF-κB的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性。b.將pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)westernblotting檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活化前后胞核與胞質(zhì)蛋白中p65的量以及胞質(zhì)蛋白中IKB的量，反應(yīng)NF-κB核轉(zhuǎn)位水平。3.Akt磷酸化水平檢測(cè)將pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pc

19、DNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)血清饑餓后用脂多糖(LPS)刺激活化。提取活化的細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblotting)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AktSer473位點(diǎn)磷酸化水平，研究野生型及突變型FKBP5對(duì)Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用有無(wú)差異。4.Akt激酶活性檢測(cè)將構(gòu)建有野生型和突變型FKBP5的慢病毒載體(LV-FKBP5(V55)/EGFP、LV-FKBP5(L55)/EGFP)分別轉(zhuǎn)染到U93

20、7細(xì)胞內(nèi)，建立表達(dá)野生型及突變型FKBP5的單克隆U937細(xì)胞系。將兩組細(xì)胞分別接種到六孔板內(nèi)，經(jīng)過(guò)兩小時(shí)血清饑餓后，加10％FBS活化細(xì)胞。提取兩組細(xì)胞的總蛋白，使用Akt激酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩組總蛋白中Akt激酶的活性。
　　結(jié)果1.FKBP5V55L突變體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，V55L氨基酸改變位于FKBP5N末端第一個(gè)β折疊內(nèi)，F(xiàn)K1結(jié)構(gòu)域的表面。亮氨酸疏水側(cè)鏈較纈氨酸更為突出，可能使得突變所在位點(diǎn)的空間位阻增

21、大，從而影響該結(jié)構(gòu)域與底物的結(jié)合能力。2.V55L突變不影響FKBP5對(duì)NF-κB信號(hào)通路活化的調(diào)控作用熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)野生型及突變型FKBP5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞之間，相對(duì)熒光素酶活性(relativeluciferaseactivity)沒(méi)有顯著差異，p=0.3624。同時(shí)，westernblotting結(jié)果顯示野生組與突變組HEK293細(xì)胞活化后，其胞內(nèi)IκB降解以及p65核轉(zhuǎn)位水平均無(wú)明顯差異。說(shuō)明該V55L突變不影響FKBP5對(duì)NF

22、-κB信號(hào)活化的調(diào)控作用。3.FKBP5V55L突變?cè)黾覣ktSer473位點(diǎn)磷酸化水平突變型FKBP5過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞在經(jīng)過(guò)活化后，其AktSer473位點(diǎn)磷酸化水平高于野生型FKBP5過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞的AktSer473磷酸水平;條帶灰度值分析證實(shí)，突變組pAkt(Ser473)/Akt比例高于野生組，p=0.0075。證明該V55L突變影響FKBP5蛋白對(duì)Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用，與野生型FKBP5相比突變的FKBP

23、5能夠增加Akt磷酸化水平。4.FKBP5V55L突變?cè)黾覣kt激酶活性Akt激酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與野生型FKBP5相比突變型FKBP5能夠增加Akt激酶對(duì)GSK-3α的磷酸化作用。證實(shí)該突變能夠增加Akt激酶活性。
　　結(jié)論FKBP5V55L突變不影響FKBP5蛋白對(duì)NF-κB活化及核轉(zhuǎn)位的調(diào)控作用。FKBP5V55L引突變體蛋白能夠增加Akt磷酸化水平，提高Akt激酶活性。
　　第三部分FKBP5V55L5C57BL/6小

24、鼠破骨細(xì)胞活性及表型研究
　　目的驗(yàn)證FKBP5V55L突變體蛋白對(duì)破骨細(xì)胞分化及破骨吸收活性的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。探索FKBP5V55L點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠paget骨病表型。
　　方法1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鑒定本實(shí)驗(yàn)中V55L+-F1代雜合子轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《山東省實(shí)施＜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例＞辦法》的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)

25、，使用V55L/-雜合子小鼠作為親代繁育子代同窩小鼠。子代小鼠鑒定:剪取小鼠尾尖組織，用50nMNaOH溶液裂解后作為DNA模板。使用PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳以及sanger測(cè)序法驗(yàn)證子代小鼠基因型，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.破骨細(xì)胞分化分離培養(yǎng)FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠骨髓來(lái)源的單核/巨噬細(xì)胞系細(xì)月包(bonemarrow-derivedmonocyte/macrophagecells，BMMs)，經(jīng)M-CSF因子(3

26、0ng/ml)及不同濃度的RANKL因子(0、30ng/ml、70ng/ml、150ng/ml)誘導(dǎo)分化3天后，通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鑒定并計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞。鑒定方法:胞核≥3個(gè)，TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞為破骨細(xì)胞。3.陷窩吸收實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs，并接種在牛骨切片上。經(jīng)M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)誘導(dǎo)分化7天后，超聲裂解切片上的細(xì)胞并用1％

27、甲苯胺藍(lán)染色。在顯微鏡下拍照并計(jì)算每個(gè)視野中吸收陷窩的面積。4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs，經(jīng)RANKL(100ng/ml)誘導(dǎo)0、1、2、3天后，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)破骨細(xì)胞相關(guān)分子NFATC1、TRAP及OSCAR表達(dá)水平。5.westernblottingFKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs，經(jīng)M-CSF(30

28、ng/ml)、RANKL(100ng/ml)誘導(dǎo)0、1、2、3天后，提取總蛋白，經(jīng)westernblotting檢測(cè)NFATC1、c-fos及LC3表達(dá)。FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠BMMs，經(jīng)M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)誘導(dǎo)分化3天后，血清饑餓4小時(shí)。加RANKL因子活化細(xì)胞0、5、10、30分鐘，立即提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)westernblot檢測(cè)Akt磷酸化、Erk磷酸化以及IKB表

29、達(dá)水平。6.小鼠股骨Micro-CT取10個(gè)月大FKBP5V55L小鼠及同窩FKBP5WT野生鼠股骨及脛骨并固定。固定后的標(biāo)本使用西門(mén)子Inveonmicro-CT檢測(cè)儀掃描。掃描結(jié)果使用儀器自帶InveonAcquisitionWorkplace和InveonResearchWorkplace平臺(tái)進(jìn)行成像及骨吸收參數(shù)分析。
　　結(jié)果1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鑒定本實(shí)驗(yàn)中V55L+-雜合子小鼠生育能力正常。經(jīng)

30、PCR瓊脂糖凝膠電泳鑒定及sanger測(cè)序分析，證實(shí)子代小鼠中FKBP5V55L、FKBP5WT及雜合小鼠出生比例基本符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。選擇同窩小鼠中的FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠作為實(shí)驗(yàn)及對(duì)照小鼠用于后續(xù)研究。2.FKBP5V55L小鼠來(lái)源的祖細(xì)胞破骨細(xì)胞分化能力增強(qiáng)小鼠破骨細(xì)胞體外分化及TRAP染色結(jié)果顯示，野生組與突變組小鼠BMMs在MCSF/RANKL誘導(dǎo)3天后，分別開(kāi)始分化為破骨細(xì)胞，且形成的破骨細(xì)胞數(shù)目隨RANK

31、L濃度增高而增加。在相同濃度的RANKL因子誘導(dǎo)下(70ng/ml、150ng/ml)，平均每個(gè)低倍視野下(40×)突變組小鼠BMMs形成的破骨細(xì)胞數(shù)目明顯多于野生小鼠（70ng/ml:FKBP5WTVSFKBP5V55L:42.7±7.6VS72.2±13.2,p=0.0284;150ng/ml:FKBP5引VSFKBP5V55L:55.7±22.1VS130.3±23.5，p=0.0162)。3.FKBP5V55L小鼠來(lái)源的破骨細(xì)胞

32、骨吸收活性增高陷窩吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每高倍視野下(100×)FKBP5V55L小鼠來(lái)源的破骨細(xì)胞形成的陷窩面積顯著大于對(duì)照小鼠來(lái)源的破骨細(xì)胞(FKBP5WTVSFKBP5V55L:4.73±1.02mm2VS8.29±0.66mm2;p=0.0071）。4.FKBP5V55L小鼠骨髓單核/巨噬細(xì)胞NFATC1、TRAP及OSCAR表達(dá)高于野生小鼠實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示野生及突變小鼠BMMs在RANKL誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄因子NFATC1及破骨細(xì)胞

33、相關(guān)分子TRAP、OSCAR表達(dá)量均顯著增高。并且在RANKL誘導(dǎo)時(shí)間相同的條件下，F(xiàn)KBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1、TRAP及OSCAR表達(dá)水平顯著高于野生小鼠。同時(shí)，Westernblotting結(jié)果顯示FKBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平高于野生小鼠，而兩組細(xì)胞之間c-fos表達(dá)量無(wú)明顯差異。5.FKBP5V55L小鼠骨髓單核/巨噬細(xì)胞Akt磷酸化水平增高FKBP5V55L小鼠來(lái)源的BMMs經(jīng)R

34、ANKL因子活化后，其胞內(nèi)Akt磷酸化水平高于對(duì)照組小鼠BMMs的Akt磷酸化水平;同時(shí)，兩組細(xì)胞之間Erk磷酸化及IκB降解水平無(wú)明顯差異。說(shuō)明FKBP5V55L可能通過(guò)調(diào)控Akt磷酸化水平影響破骨細(xì)胞分化及參與PDB發(fā)病。6.FKBP5V55L小鼠表現(xiàn)出部分PDB表型小鼠股骨近端Micro-CT骨參數(shù)分析結(jié)果顯示，與野生小鼠相比FKBP5V55L小鼠股骨:相對(duì)骨體積(Bonevolum/TotMvolum，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(

35、TrabecularNumber,Tb.N)、骨小梁厚度(TrabecularThinckness，Tb.Th)減少;而骨小梁分離度(TrabecularSpacing，Tb.Sp)、骨小梁模式因子(TrabecularBonePatternfactor，TBPf)增加。FKBP5V55L小鼠呈現(xiàn)出明顯的小梁骨過(guò)度吸收表現(xiàn)，與體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的破骨細(xì)胞分化及骨吸收能力增加相對(duì)應(yīng)。然而，F(xiàn)KBP5V55L小鼠Micro-CT檢測(cè)未見(jiàn)異常的骨皮

36、質(zhì)增厚及擴(kuò)張表現(xiàn)。股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端部位3D骨重建結(jié)果顯示，三只FKBP5V55L小鼠中有兩只小鼠的股骨遠(yuǎn)端骨皮質(zhì)出現(xiàn)可疑的骨吸收陷窩，而三只FKBP5WT小鼠中未見(jiàn)該改變。提示FKBP5V55L小鼠體內(nèi)存在溶骨增加性病理改變，部分符合PDB表型。
　　結(jié)論FKBP5V55L突變?cè)黾有∈篌w外破骨細(xì)胞分化及骨吸收能力。FKBP5V5L突變主要通過(guò)增加Akt/NFATC1信號(hào)通路來(lái)調(diào)控破骨細(xì)胞分化能力。FKBP5幅V55L突變?cè)黾有∈?/p>