GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變及過表達(dá)突變在帕金森病中的作用研究.pdf

1、本主要從以下幾個(gè)方面展開論述:
　　第一部分 帕金森病基因多態(tài)性研究
　　第一節(jié) GAPDH基因多態(tài)性與PD關(guān)聯(lián)分析
　　目的：采用病例對照研究，對PD患者與正常對照組中GAPDH基因進(jìn)行遺傳學(xué)分析，并探討GAPDH基因與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)性。
　　方法：收集265例原發(fā)性PD患者和性別、年齡匹配的269例正常人外周血，采用外周血DNA提取試劑盒，提取基因組DNA。采用SNaPshot的方法檢測目的基因并分析結(jié)果

2、。
　　結(jié)果：所測GAPDH基因中其5’非編碼區(qū)點(diǎn)rs1136666基因多態(tài)性，與PD發(fā)病相關(guān)。其中G為保護(hù)堿基，且此點(diǎn)男性病例對照研究統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異性，而女性研究無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此點(diǎn)在早發(fā)組病例對照研究中等位基因頻率研究有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但基因型研究無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在晚發(fā)組等位基因頻率研究及基因型研究均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：GAPDH基因5’非編碼區(qū)點(diǎn)rs1136666多態(tài)性與PD發(fā)病相關(guān)，且其相關(guān)性與性別、年齡有關(guān)。男性、

3、老齡是該基因與PD相關(guān)發(fā)病的危險(xiǎn)因素。
　　第二節(jié) NCAPD2、GAPDH家族、PKP2P1、PPM1H、CD9、ETV6基因多態(tài)性與PD相關(guān)性分析
　　目的：采用病例對照研究，對PD患者與正常對照組中基因組其他入組基因進(jìn)行遺傳學(xué)分析，并探討這些基因與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)性。
　　方法：收集265例原發(fā)性PD患者和性別、年齡匹配的269例正常人外周血，采用外周血DNA提取試劑盒，提取基因組DNA。采用SNaPshot的

4、方法檢測目的基因并分析結(jié)果。
　　結(jié)果：GAPDH基因上游NCAPD2基因中rs7311174、rs2072374位點(diǎn)基因多態(tài)性在PD病例對照研究中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而rs740850位點(diǎn)基因多態(tài)性在PD病例對照研究中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GAPDH家族位點(diǎn)中 rs2029721、rs4806173、rs12984928基因多態(tài)性在PD病例對照研究中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs10492243在此次研究中與PD有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性。rs2008134、rs

5、342169、rs740839、rs732868在此次病例對照研究中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：NCAPD2基因與PD發(fā)病相關(guān)。GAPDH家族中位點(diǎn)所納入此次研究的三個(gè)點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)與PD相關(guān)聯(lián)。
　　第二部分 GAPDH基因突變與PD關(guān)系研究
　　第一節(jié) 魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞的氧化水平研究
　　目的：觀察魚藤酮干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)氧化水平的變化。
　　方法：進(jìn)行SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞按

6、濃度梯度分組，MTT法摸索最佳干預(yù)濃度。光鏡下觀察各濃度梯度細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。使用DCFH-DA處理細(xì)胞后流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞內(nèi)氧化水平變化；采用SOD Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性水平；采用TBARS Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。
　　結(jié)果：MTT檢測細(xì)胞活力摸索出細(xì)胞最適干預(yù)濃度為500nM，且細(xì)胞活力與干預(yù)濃度呈濃度依賴性。光鏡下觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度處理的細(xì)胞，200nM少量細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，隨著濃

7、度的改變，細(xì)胞形態(tài)學(xué)及細(xì)胞數(shù)量減少的更為明顯，2M的魚藤酮加入培養(yǎng)基后細(xì)胞幾乎停止生長，突起消失變圓。使用 DCFH-DA處理500nM魚藤酮處理后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；SOD Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性水平降低；采用TBARS Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)。
　　結(jié)論：魚藤酮干預(yù)細(xì)胞后能使細(xì)胞內(nèi)氧化水平升高，SOD水平降低，脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)。
　　第二節(jié) GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變對細(xì)

8、胞功能的影響
　　目的：構(gòu)建rs1136666點(diǎn)突變載體，探討GAPDH基因突變與PD的關(guān)系。
　　方法：進(jìn)行SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)，克隆點(diǎn) rs1136666點(diǎn)所在片段。根據(jù)分組采用魚滕鲖或載體單個(gè)或同時(shí)進(jìn)行干預(yù)細(xì)胞。摸索載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的合適濃度及轉(zhuǎn)染時(shí)間以及檢驗(yàn)時(shí)間。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察各組中GAPDH基因表達(dá)情況。使用western blot觀察各組細(xì)胞中GAPDH表達(dá)的情況及觀察各組中凋亡的情況。使用SOD As

9、say kit檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性水平；采用TBARS Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。使用流式細(xì)胞儀對各組細(xì)胞中神經(jīng)元凋亡進(jìn)行檢測，比較各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后細(xì)胞凋亡的情況；使用DCFH-DA處理細(xì)胞后在流式細(xì)胞儀中檢測，對各組細(xì)胞中神經(jīng)元中氧化應(yīng)激水平作出比較。
　　結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR示GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變引起細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)降低；western blot示GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變可引起細(xì)胞內(nèi)凋亡

10、蛋白表達(dá)增高，抗凋亡蛋白表達(dá)降低，GAPDH表達(dá)增高。而GAPDH突變轉(zhuǎn)染與rot聯(lián)用可增強(qiáng)凋亡作用。流式細(xì)胞儀中觀察到GAPDH突變轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡增加，加用魚藤酮后，凋亡作用更強(qiáng)。DCFH-DA處理后的細(xì)胞可見GAPDH突變轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中ROS水平增高，魚藤酮可增強(qiáng)這一作用。GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi) SOD水平下降，GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平增高，而魚藤酮使SOD水平下降及脂質(zhì)過氧化增

11、高得更明顯。
　　結(jié)論：GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變，可引起mRNA表達(dá)異常，蛋白折疊障礙，異常GAPDH聚集，最終引起細(xì)胞死亡，加入魚藤酮后，細(xì)胞內(nèi)凋亡各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生改變。
　　第三節(jié) GAPDH過表達(dá)對細(xì)胞功能的影響
　　目的：構(gòu)建 GAPDH過表達(dá)載體，探討 GAPDH基因過表達(dá)與 PD的關(guān)系。GAPDH基因過表達(dá)與GAPDH突變共同在PD中的關(guān)系研究。
　　方法：進(jìn)行SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建GAPDH

12、過表達(dá)載體。根據(jù)分組采用魚滕鲖或載體單個(gè)或同時(shí)進(jìn)行干預(yù)細(xì)胞。摸索載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的合適濃度及轉(zhuǎn)染時(shí)間以及檢驗(yàn)時(shí)間。使用DCFH-DA處理細(xì)胞后在流式細(xì)胞儀中檢測，對各組細(xì)胞中神經(jīng)元中氧化應(yīng)激水平作出比較。用SOD Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性水平；采用TBARS Assay kit檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。使用western blot觀察各組細(xì)胞中GAPDH表達(dá)的情況及觀察各組中凋亡情況。使用流式細(xì)胞儀對各組細(xì)胞中神經(jīng)元凋亡進(jìn)行檢

13、測，比較各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后細(xì)胞凋亡的情況。使用非變性PAGE膠印跡GAPDH基因5’非編碼區(qū)突變及GAPDH過表達(dá)以及魚藤酮處理細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)GAPDH多聚體表達(dá)情況。
　　結(jié)果：western blot示過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)GAPDH表達(dá)增高，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡增多。DCFH-DA示過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中ROS水平增高。而當(dāng)GAPDH突變與過表達(dá)同時(shí)存在時(shí)這一作用被增強(qiáng)。非變性 PAGE膠印跡示 GAPDH基因5’非編碼區(qū)突