Livin通過(guò)激活p38-GSK3β通路促進(jìn)乳腺癌上皮--間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì)乳腺癌已位居全球女性惡性腫瘤之首，并嚴(yán)重影響了女性的健康。其發(fā)病率和致死率仍然高居不下，尤其是發(fā)病率還在不斷增加。而乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。Estrogen receptor(ER)、progesteronereceptor(PR)及human epidermal growth factor receptor-2(HER-2)均呈陰性表達(dá)的三陰性乳腺癌，則具有更強(qiáng)侵襲力、較易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特點(diǎn)。

2、>　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。因此研究乳腺癌EMT發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)于改善預(yù)后，提高患者的生存率至關(guān)重要。Livin是凋亡抑制蛋白家族之新成員，能夠與凋亡蛋白酶結(jié)合，抑制其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，并與腫瘤的惡性程度增高及不良預(yù)后相關(guān)。最新報(bào)道，Livin可促進(jìn)結(jié)直腸癌EMT發(fā)生。而Livin在乳腺癌EMT和轉(zhuǎn)移中的作用及潛在機(jī)

3、制尚不清楚。近些年逐漸有報(bào)道，p38和糖原合成激酶3β（glycogen synthesis kinase，GSK3β）與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及EMT發(fā)生有關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，抑制p38通路活性可下調(diào)p-GSK3β表達(dá)水平，從而增加GSK3β活性，降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。那么，Livin能否通過(guò)激活p38/GSK3β通路調(diào)控EMT過(guò)程，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移成為我們主要探討的問(wèn)題。
　　本研究主要探討了p38/GSK3β通路在L

4、ivin調(diào)控乳腺癌EMT發(fā)生中的作用及機(jī)制，不僅對(duì)Livin在乳腺癌中的生物學(xué)功能的研究加以補(bǔ)充，而且還將為乳腺癌EMT發(fā)生機(jī)制的研究提供新思路。
　　目的:
　　1、檢測(cè)Livin在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)并分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2、研究Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力和EMT的影響。
　　3、探討p38/GSK3β通路在Livin誘導(dǎo)乳腺癌EMT中的作用機(jī)制。
　　方法:

5、>　　1、檢測(cè)Livin在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)并分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　(1)收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的150例乳腺癌組織（包括33例三陰性乳腺癌和117例非三陰性乳腺癌）及30例癌旁非腫瘤組織蠟塊標(biāo)本。另收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的16對(duì)新鮮原發(fā)性乳腺癌和相應(yīng)癌旁非腫瘤組織標(biāo)本。
　　(2)Western blot和Real time RT-PC

6、R檢測(cè)乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞系中Livin表達(dá)情況。
　　(3)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Livin在乳腺癌組織中的表達(dá)，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2、研究Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力和EMT的影響
　　(1)在Livin相對(duì)表達(dá)量低的非三陰性乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Livin，在Livin相對(duì)表達(dá)量高的三陰性乳腺癌細(xì)胞系中敲除Livin。
　　(2)通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移和Matri

7、gel侵襲實(shí)驗(yàn)探討Livin對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　　(3)通過(guò)Western blot、免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)探討Livin對(duì)乳腺癌EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　3、探討p38/GSK3β通路在Livin誘導(dǎo)乳腺癌EMT中的作用機(jī)制
　　(1)通過(guò)Westernb lot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞敲除或過(guò)表達(dá)Livin對(duì)p38/GSK3β通路相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　(2)通過(guò)Western blot檢測(cè)加

8、入p38和GSK3β通路抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞p38/GSK3β通路相關(guān)分子及EMT相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、Livin在乳腺癌組織中高表達(dá)
　　(1)乳腺癌組織中Livin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于相應(yīng)癌旁非腫瘤組織。
　　(2)Livin主要于乳腺癌癌細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)。Livin在乳腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于在癌旁非腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率。
　　2、Livin在乳腺癌細(xì)胞系中高表

9、達(dá)
　　(1)Livin在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯高于正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞系。
　　(2)Livin在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中表達(dá)高于非三陰性乳腺癌MCF-7細(xì)胞系。
　　3、Livin表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征具有相關(guān)性
　　(1)Livin的陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌（特別是三陰性乳腺癌）的高TNM分期和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。
　　(2)Li

10、vin在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率略高于在非三陰性乳腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率。
　　4、Livin促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲
　　(1)Livin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒明顯增強(qiáng)了Livin的表達(dá)水平，Livin-siRNA干擾質(zhì)粒明顯抑制了Livin的表達(dá)。
　　(2)Livin過(guò)表達(dá)組MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng);而Livin干擾組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。
　　5、Livin調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EM

11、T過(guò)程
　　(1)Livin過(guò)表達(dá)組的MCF-7細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，同時(shí)伴隨著Snail、MMP-2、MMP-7表達(dá)增加，而Slug表達(dá)無(wú)明顯變化;而Livin干擾組的MDA-MB-231細(xì)胞E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)，同時(shí)伴隨著Snail、MMP-2、MMP-7表達(dá)降低，Slug表達(dá)也無(wú)明顯變化。
　　(2)

12、免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，Livin過(guò)表達(dá)使MCF-7細(xì)胞的E-cadherin降低，N-cadherin和Vimentin增強(qiáng);而干擾Livin則引起MDA-MB-231細(xì)胞的E-cadherin增高，N-cadherin和Vimentin降低。
　　(3)Livin表達(dá)與三陰性乳腺癌N-cadherin和Vimentin表達(dá)正相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān);Livin表達(dá)與非三陰性乳腺癌Vime

13、ntin表達(dá)正相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與N-cadherin表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。
　　6、p38/GSK3β通路參與并影響Livin調(diào)控的乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程
　　(1)在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Livin后，上調(diào)了p-p38、p-ATF2和p-GSKββ的表達(dá);而在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中干擾Livin表達(dá)后，p-p38、p-ATF2和p-GSKββ的表達(dá)降低。
　　(2)在乳腺癌MCF

14、-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Livin后加入p38的特異性抑制劑SB203580，p-ATF2、p-GSK3β以及Vimentin和N-cadherin表達(dá)則不再上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)也不再下調(diào)。轉(zhuǎn)染Livin后加入GSK3β抑制劑SB216763，p-GSK3β、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)進(jìn)一步增加，而E-cadherin表達(dá)則明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1、Livin在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)增加，并與乳腺