HSP70抑制LPS所致細(xì)胞因子表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、本研究從調(diào)控炎癥介質(zhì)基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討熱休克反應(yīng)(heat shock response，HSR)以及HSP70抑制LPS所致細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制。 經(jīng)采用RT-PCR、ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌脂多糖(LPS)可誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量TNF-α，IL-1β和IL-15等細(xì)胞因子。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受熱休克反應(yīng)(42.5℃1h，恢復(fù)12h)后再進(jìn)行LPS刺激，則LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)受到抑制。在此基礎(chǔ)上

2、采用過表達(dá)HSP70的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HSP70同樣抑制了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)。 鑒于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控炎癥介質(zhì)基因表達(dá)中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用磷酸化抗體檢測MAPK信號(hào)通路的活化，分析了HSR以及HSP70對(duì)LPS所致MAPK信號(hào)通路活化的影響。Westem blot結(jié)果顯示，HSR以及HSP70自身均不影響MAPK的活化(磷酸化)。在LPS刺激30min后，HSR組以及HSP70過表達(dá)組中的JNK、E

3、RK、p38的活化(磷酸化)程度與非HSR正常細(xì)胞組或轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞組比較均無明顯區(qū)別。EMSA結(jié)果顯示，HSR以及HSP70不影響LPS刺激所致的MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1的DNA結(jié)合活性。據(jù)此我們認(rèn)為，HSR以及HSP70不影響LPS所致的MAPK信號(hào)通路活化，其抑制LPS所致細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制可能涉及其他因素。 由于NF-κB／IκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化在LPS所致炎癥反應(yīng)的發(fā)生中具有重要作用，我們進(jìn)一步分析了HSP70過表

4、達(dá)對(duì)LPS所致NF-κB信號(hào)通路活化的影響。通過免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)及Westem blot等技術(shù)檢測NF-κB(p65)的核移位，我們發(fā)現(xiàn)HSP70高表達(dá)明顯抑制了LPS刺激60 min所致的NF-κB(p65)核移位及LPS刺激20 min所致的IκB降解。EMSA結(jié)果顯示，在LPS處理60 min，熱休克反應(yīng)以及HSP70高表達(dá)明顯抑制LPS所致的NF-κB的DNA結(jié)合活性。 由于IκBa的降解涉及IκBa的磷酸化，而I

5、κBα的磷酸化是由IκB的激酶IKK以及相應(yīng)的磷酸酯酶相互影響、協(xié)同作用的結(jié)果。因此，我們進(jìn)一步分析了HSR以及HSP70對(duì)細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶活性的影響。在熱休克恢復(fù)8h、12h、24h后，細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶活性明顯增高。在LPS刺激30min或1h后，HSR組細(xì)胞內(nèi)的磷酸酯酶活性仍高于非HSR對(duì)照組細(xì)胞。同樣，過表達(dá)的HSP70也增高了細(xì)胞內(nèi)的磷酸酯酶活性。 在此基礎(chǔ)上，我們采用磷酸酯酶抑制劑okadaic acid(OA)分析細(xì)胞內(nèi)

6、磷酸酯酶活性受抑制時(shí)，HSR和HSP70對(duì)LPS所致NF-κB信號(hào)通路活化以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)歷熱休克反應(yīng)的細(xì)胞以及HSP70過表達(dá)細(xì)胞受OA處理后再經(jīng)LPS刺激，其表達(dá)、釋放的IL-1水平與單純LPS刺激細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-1無明顯區(qū)別。免疫熒光顯示，OA處理后，熱休克反應(yīng)以及HSP70高表達(dá)均不能明顯抑制LPS所致的NF-κB(p65)的核移位。 另外，我們通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的IISP70與IκB激