人參皂苷Rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠軸突再生及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，在我國腦卒中致死率已位居所有病因的首位。同時(shí)，目前中國腦血管病發(fā)病率亦居世界首位，高于美國近1倍。其中缺血性腦卒中占總數(shù)的80％~85%。世界衛(wèi)生組織調(diào)查結(jié)果顯示，缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，在幸存的腦卒中患者中，尤其是致殘的患者，其健康和生存質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，并給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。
　　研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后常表現(xiàn)出神經(jīng)功能一定程度的

2、恢復(fù)，提示腦組織具有一定程度的自我修復(fù)能力。這種自我修復(fù)能力與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)，而軸突再生則是神經(jīng)重塑的重要過程。之前通過對(duì)動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后給予適當(dāng)?shù)乃幬锘蜻\(yùn)動(dòng)鍛煉等干預(yù)措施，可以刺激腦組織內(nèi)源性軸突再生，有利于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重新連接，以代償一部分失神經(jīng)支配區(qū)域的神經(jīng)功能。因此，尋找適合、有效的藥物以促進(jìn)缺血性腦卒中患者的康復(fù)和預(yù)后，提高生存質(zhì)量，一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和方向。近年來，祖國傳統(tǒng)中草藥對(duì)于卒中治療的積極作用已越來越

3、受到國內(nèi)外的重視，其具有效果明顯、副作用小、多靶點(diǎn)、多方向和多途徑等眾多優(yōu)點(diǎn)，所以我們致力于從中草藥中篩選出有利于卒中恢復(fù)的藥物。
　　人參是我國的傳統(tǒng)中藥，被用于多種疾病的治療和預(yù)防。人參皂苷Rb1（GRb1）是人參的主要活性成分，早已被證實(shí)可在腦缺血急性期通過抗氧化和抗炎等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。它可通過PKA信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還被發(fā)現(xiàn)可在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖等。這些作用都與腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)密切

4、相關(guān)。然而人參皂苷Rb1在腦梗死后慢性期的作用以及是否可以促進(jìn)中樞神經(jīng)的軸突再生尚沒有明確的文獻(xiàn)支持。
　　本研究選用雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，電凝法建立小鼠局灶性大腦中動(dòng)脈皮層梗死（distal middle cerebral arteryocclusion,dMCAO）模型，觀察腦缺血后應(yīng)用GRb1治療后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況、軸突再生的形態(tài)學(xué)變化及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP43）的表達(dá)、cAMP和PKA的水平以及PKAc

5、與p-CREB的蛋白表達(dá)，以探討GRb1是否可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)和軸突再生以及其發(fā)揮作用的潛在機(jī)制。同時(shí)，我們引入PKA抑制劑H89作為對(duì)比觀察，以進(jìn)一步確認(rèn)GRb1與PKA通路的關(guān)系。造模后3天、7天、14天和28天作為實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間點(diǎn)。本研究分三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容分別概述如下。
　　第一部分：人參皂苷Rb1對(duì)局灶性腦梗死小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用
　　目的：
　　通過觀察局灶性腦梗死小鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的情況，研究GRb1

6、在腦梗死后慢性期對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)是否具有促進(jìn)作用以及起效時(shí)間。
　　方法：
　　選用成年雄性 C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，采用電凝法制備大腦中動(dòng)脈皮層梗死模型。隨機(jī)將 C57BL/6小鼠分為5組：假手術(shù)組(Sham)、梗死組(MCAO)、GRb1治療組(GRb1)(MCAO+GRb1,50mg/kg)、H89干預(yù)組(M+H)(MCAO+H89，2μl,i.c.v.)、GRb1和H89干預(yù)組干預(yù)組(M+H+G)(MCAO1+

7、H89++GRb1)。Sham組：假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組：術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。GRb1組：術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50mg/kg。M+H組：術(shù)前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。M+H+G組：術(shù)前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50 mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次，持續(xù)至術(shù)后14天。
　　于術(shù)后3天、7天、14天和28天進(jìn)行Ro

8、tarod實(shí)驗(yàn)和平衡木腳步失誤實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.Rotarod實(shí)驗(yàn)：Sham組幾乎沒有運(yùn)動(dòng)功能缺損表現(xiàn)，平均跑輪時(shí)間大于300s,而其它各組平均跑輪時(shí)間均低于300s。與 MCAO組相比，GRb1組跑輪時(shí)間在術(shù)后14天和28天更長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；M+H組與M+H+G組在術(shù)后7天、14天、28天均低于MCAO組（P<0.05），并且這兩組之間沒有明顯的差異（P>0.05）；
　　2.平衡木腳

9、步失誤實(shí)驗(yàn)：Sham組在行走中幾乎沒有腳步失誤，而其它各組均出現(xiàn)不同程度的腳步失誤。GRb組腳誤次數(shù)在術(shù)后7天、14天和28天少于MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而M+H組與M+H+G組在術(shù)后7天、14天和28天的腳誤次數(shù)均多于MCAO組（P<0.05），并且這兩組之間沒有明顯的差異（P>0.05）。
　　第二部分：人參皂苷Rb1對(duì)局灶性腦梗死小鼠軸突再生的影響
　　目的：
　　觀察腦缺血梗死后皮層內(nèi)軸突

10、再生的變化，研究GRb1在腦梗死后慢性期是否具有促進(jìn)軸突再生的作用。
　　方法：
　　以成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，采用電凝法制備大腦中動(dòng)脈皮層梗死模型。隨機(jī)將C57BL/6小鼠分為2組：A組和B組，每組又分為5個(gè)亞組：假手術(shù)組(Sham)、梗死組(MCAO)、GRb1治療組(GRb1)(MCAO+GRb1,50mg/kg)、H89干預(yù)組（M+H）(MCAO+H89，2μl,i.c.v.)、GRb1和H89干預(yù)組（

11、M+H+G）(MCAO1+H89++GRb1)。Sham組：假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水；MCAO組：術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水；GRb1組：術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50 mg/kg；M+H組：術(shù)前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水；M+H+G組：術(shù)前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50 mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次，持續(xù)至術(shù)后14天。術(shù)后14天對(duì)B組小鼠健側(cè)

12、感覺運(yùn)動(dòng)皮層注射生物素葡聚糖安（BDA，2μl）。
　　A組分別于術(shù)后3天、7天、14天和28天取材并應(yīng)用免疫熒光法觀察梗死周圍皮層內(nèi)GAP43的表達(dá)；應(yīng)用western blot和qRT-PCR的方法檢測(cè)梗死周圍皮層內(nèi)GAP43蛋白水平和mRNA水平。B組于術(shù)后28天取材，應(yīng)用免疫組化法和免疫熒光觀察雙側(cè)皮層內(nèi)被BDA標(biāo)記的神經(jīng)元或軸突，應(yīng)用免疫熒光雙染觀察梗死周圍皮質(zhì)內(nèi) BDA與 GAP43共定位情況。
　　結(jié)果：

13、>　　1.A組梗死周圍皮層GAP43熒光表達(dá)：與MCAO組相比，GRb1組在術(shù)后7天、14天和28天增多，同時(shí)M+H組與M+H+G組表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），M+H+G組表達(dá)在術(shù)后7天和14天多于M+H組（P<0.05）；sham組始終低表達(dá)，且低于MCAO組（P<0.05）；
　　2.A組梗死周圍皮層GAP43蛋白和mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致：與MCAO組相比，GRb1組在術(shù)后7天、14天和28天升高；M+H組與

14、M+H+G組在術(shù)后7天、14天表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），M+H+G組表達(dá)在術(shù)后7天和14天多于M+H組（P<0.05）；sham組始終低于MCAO組；
　　3.B組免疫組化染色觀察可發(fā)現(xiàn)各缺血組的健側(cè)和缺血側(cè)皮層有一定量BDA標(biāo)記的神經(jīng)元或軸突纖維，sham組只有極少數(shù)BDA標(biāo)記的神經(jīng)元和軸突；
　　4.B組通過免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)GRb1組小鼠健側(cè)皮層內(nèi)被標(biāo)記的神經(jīng)元和軸突的數(shù)目略高于其它組（P<0.05

15、），除sham組較少外，其余各組無顯著差異（P>0.05）；缺血側(cè)皮層內(nèi)被標(biāo)記軸突纖維的數(shù)目：與MCAO組相比，GRb1組較多，而M+H組與M+H+G組較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），M+H+G組略多于M+H組（P<0.05）；sham組數(shù)量較低；
　　5.B組觀察梗死周圍皮質(zhì)內(nèi)BDA與GAP43共定位區(qū)域發(fā)現(xiàn)，MCAO組共染的陽性面積少于GRb1組，但多于M+H組與M+H+G組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），M+H+

16、G組與 M+H組并無顯著差異（P>0.05）；sham組共染陽性面積也低于MCAO組。
　　第三部分：人參皂苷Rb1促進(jìn)局灶性腦梗死小鼠腦內(nèi)軸突再生與PKA信號(hào)通路的聯(lián)系
　　目的：
　　觀察局灶性梗死小鼠腦組織內(nèi)PKA信號(hào)通路相關(guān)分子的變化，研究GRb1促進(jìn)梗死后軸突再生的機(jī)制是否與PKA信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法：
　　選用成年雄性C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，采用電凝法制備大腦中動(dòng)脈皮層梗死模型。隨機(jī)將

17、C57BL/6小鼠分為5組：假手術(shù)組（Sham）、梗死組(MCAO)、GRb1治療組（GRb1）（MCAO+GRb1,50 mg/kg）、H89干預(yù)組（M+H）（MCAO+H89，2μl,i.c.v.）、GRb1和H89干預(yù)組（M+H+G）（MCAO1+H89++GRb1）。Sham組：假手術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組：術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。GRb1組：術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50 mg/kg。M+H組：術(shù)

18、前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射等量生理鹽水。M+H+G組：術(shù)前給予腦室注射H89溶液2μl，術(shù)后24h腹腔注射GRb1溶液50 mg/kg。給藥或溶劑次數(shù)為每日一次，持續(xù)至術(shù)后14天。
　　分別于術(shù)后3天、7天、14天和28天取材，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)雙側(cè)大腦皮層內(nèi)cAMP和PKA的水平，應(yīng)用western blot法檢測(cè)雙側(cè)大腦皮層內(nèi)PKAc和p-CREB蛋白水平。
　　結(jié)果：

19、　　1.大腦皮層內(nèi)的cAMP水平：各缺血組在術(shù)后3天低于sham組；與MCAO組相比，sham組與M+H組在術(shù)后7天和14天水平較低，GRb1組和M+H+G組在術(shù)后7天、14天和28天較高（P<0.05）；與M+H+G組相比，GRb1組在術(shù)后14天較高，M+H組在術(shù)后7天、14天和28天較低（P<0.05）；
　　2.大腦皮層內(nèi)的PKA水平：各缺血組在術(shù)后3天低于sham組；與MCAO組相比，sham組、M+H+G組和M+H組在術(shù)

20、后7天14天的水平較低， GRb1組則在術(shù)后7天、14天和28天較高（P<0.05）；與M+H組相比，M+H+G組在術(shù)后7天和14天較高（P<0.05）；
　　3.通過western bolt檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腦皮層內(nèi)的PKAc與p-CREB的蛋白表達(dá)趨勢(shì)基本一致：與MCAO組相比，GRb1組在術(shù)后7天、14天和28天表達(dá)上調(diào)，M+H+G組和M+H組在術(shù)后7天、14天和28天表達(dá)下調(diào)，M+H+G組的蛋白表達(dá)在術(shù)后7天和14天高于M+H組，