自噬調(diào)控高滲下人角膜上皮細(xì)胞的NLRP3炎癥小體的激活.pdf

1、目的:
　　以高滲誘導(dǎo)下的人角膜上皮細(xì)胞(HCECs)為研究對(duì)象，模擬干眼癥患者的眼表微環(huán)境，研究自噬是否通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活來介導(dǎo)干眼炎癥反應(yīng)。
　　方法:
　　將永生化的人角膜上皮細(xì)胞（12-SV40細(xì)胞系）分別置于500 mOsm滲透壓培養(yǎng)基2h、4h、6h、8h、10h、12h模擬眼表炎癥下的上皮細(xì)胞，設(shè)正常滲透壓培養(yǎng)基組（對(duì)照組，培養(yǎng)基滲透壓為310 mOsm）。用real-time PCR檢測(cè)H

2、CECs中炎癥小體各組分NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)反映，Western-blot檢測(cè)LC3-II的蛋白水平表達(dá)變化趨勢(shì)反映細(xì)胞自噬的水平，并選擇出最合適的高滲透壓刺激時(shí)間為細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)先加入自噬抑制劑3-MA使3-ma濃度分別達(dá)到0、2.5、5、7.5、10mmol/L，將HCECs置于含自噬抑制劑3-MA的細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理3h后，予500mOsm高滲透壓（HOP）刺激

3、，同時(shí)設(shè)310 mOsm正常滲透壓（NOP）組驗(yàn)證高滲誘導(dǎo)炎癥模型建議模型是否成功，用Western-blot檢測(cè)LC3-II的蛋白表達(dá)水平變化反映自噬水平的變化。用real-time PCR檢測(cè)HCECs炎癥小體各組分NLRP3、asc、caspase-1；炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA基因表達(dá)水平,用免疫熒光方法觀察LC3的熒光聚集變化情況。根據(jù)ATG-5基因序列設(shè)計(jì)合成靶向人ATG-5的干擾RNA，同時(shí)設(shè)正常滲透

4、壓對(duì)照組（NOP）、高滲透壓對(duì)照組（HOP）、陰性轉(zhuǎn)染加高滲透壓對(duì)照組（HOP+siNC）和轉(zhuǎn)染加高滲透壓（HOP+siATG-5）組。用同樣的方法檢測(cè)上述炎癥因子、炎癥小體組分、細(xì)胞自噬相關(guān)基因及細(xì)胞凋亡的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.建立人角膜上皮細(xì)胞炎癥模型
　　根據(jù)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常滲透壓組相比較，2h高滲透壓刺激組的NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞

5、0.05），而4h高滲透壓刺激組、6h高滲透壓刺激組、8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組的NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常滲透壓組相比較，2h高滲透壓刺激組、4h高滲透壓刺激組的LC3的蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而6h高滲透壓刺激組、8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組的LC3的蛋白表達(dá)

6、水平明顯升高（P＜0.01）。將各組結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)6h高滲透壓刺激組Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果與2h高滲透壓刺激組、4h高滲透壓刺激組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。因此，我們選擇6h高滲透壓刺激作為該細(xì)胞干眼模型的條件。
　　2.改變?nèi)私悄ど掀ぜ?xì)胞自噬水平后對(duì)高滲環(huán)境下人角膜上皮細(xì)胞炎癥小體各

7、組分表達(dá)、炎癥因子表達(dá)、自噬相關(guān)基因及凋亡的表達(dá)情況
　　在自噬抑制劑3-MA對(duì)HCECs預(yù)處理3h后，予500mOsm高滲透壓（HOP）刺激6h。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純高滲透壓組相比較，不同抑制劑濃度梯度下（2.5、5、7.5、10mmol/L），LC3-II的表達(dá)均下降（P＜0.05），p62的表達(dá)當(dāng)3-MA抑制劑濃度≥7.5 mmol/L時(shí)均升高（P＜0.05），ATG-5的表達(dá)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0

8、.05），當(dāng)3-MA抑制劑濃度≥7.5 mmol/L時(shí)，NLRP3表達(dá)明顯升高（P＜0.05），因此我們?cè)O(shè)定3-MA濃度為10 mmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純高滲透壓組相比較，3-MA+高滲透壓的IL-1、βIL-6及IL-8mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與單純高滲透壓組相比較，3-MA+高滲透壓的ASC、NLRP3及caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。<

9、br>　　在成功轉(zhuǎn)染siATG-5后，予500mOsm高滲透壓（HOP）刺激6h。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與普通滲透壓組、單純高滲透壓組及siNC+高滲透壓組相比較， siATG-5+高滲刺激組ATG-5蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01）；與，普通滲透壓組相比，p62的表達(dá)在siATG-5+高滲刺激組明顯上升（P＜0.05）；siATG-5+高滲刺激組與普通滲透壓組相比LC3-II的表達(dá)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），與

10、siNC+高滲透壓組相比LC3-II的表達(dá)明顯降低；與其他各組相比，siATG-5+高滲刺激組的NLRP3蛋白表達(dá)量明顯上升。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與普通滲透壓組、單純高滲透壓組及siNC+高滲透壓組， siATG-5+高滲刺激組的IL-1β、IL-6、IL-8、NLRP3、caspase-1及ASC的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.高滲刺激下的HCECs，細(xì)胞的自噬水平明顯