高滲鹽水通過EGFR信號(hào)通路減輕血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　各種原因如顱腦疾病以及全身性疾病導(dǎo)致腦水腫是急危重癥患者的重要致殘和死亡原因。高滲鹽水(HS)與甘露醇均已被《ASA/AHA2007自發(fā)性腦出血治療指南》明確推薦為一線降顱壓藥物。但證據(jù)顯示，甘露醇有惡化腎功能、低容量反應(yīng)和腦水腫“反彈”現(xiàn)象。近年研究發(fā)現(xiàn)，HS在治療腦水腫顱高壓方面比傳統(tǒng)的甘露醇更有優(yōu)勢(shì)，效果更好，作用更持久，也無(wú)顱內(nèi)壓“反彈現(xiàn)象”。
　　HS減輕腦水腫的機(jī)制未完全明了。產(chǎn)生腦水腫的主要原因是血

2、腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的破壞，而作為構(gòu)成BBB基礎(chǔ)的內(nèi)皮細(xì)胞，則是關(guān)鍵。內(nèi)皮細(xì)胞以及由其形成的緊密連接位于血管腔內(nèi)側(cè)，是HS治療腦水腫最直接、也是最先接觸的部位。因此，保護(hù)BBB的內(nèi)皮細(xì)胞是防治腦水腫的重要靶點(diǎn)。我們已發(fā)現(xiàn)，HS可通過減少腦梗死灶周圍小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-1β等非滲透性機(jī)制減輕腦水腫，但HS是否具有保護(hù)BBB內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng)以及其作用機(jī)制如何，目前尚未清楚。
　　目

3、的:
　　研究HS是否可減輕缺血缺氧導(dǎo)致BBB內(nèi)皮細(xì)胞損傷并探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　本研究將采用測(cè)定腦組織Evans藍(lán)、PCR、MTS、Western blot、流式、TUNEL、免疫熒光、免疫組化、透射電鏡以及腺病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)等技術(shù)，通過動(dòng)物體內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)層面探討HS對(duì)BBB內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，并進(jìn)一步利用基因測(cè)序等方法研究HS減輕缺血缺氧導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　結(jié)果:
　　首

4、先，通過構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，分假手術(shù)組，模型組，生理鹽水組和HS組（10％的HS）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腦缺血組和生理鹽水組比較，10％的HS組的腦組織Evans藍(lán)定量顯著減少(P＜0.05)，但仍然較假手術(shù)組增加(P＜0.05);而缺血組與生理鹽水組之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，缺血組的BBB的緊密連接、內(nèi)皮細(xì)胞皺縮、細(xì)胞空泡形成等結(jié)構(gòu)明顯破壞，但HS處理后，以上破壞顯著減輕。
　　其次，體外構(gòu)建糖氧剝奪模型(OGD

5、)，以40mmol/L的HS干預(yù)bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞，通過細(xì)胞活力測(cè)定、流式和TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡、透射電鏡等技術(shù)發(fā)現(xiàn):與ODG組相比，HS組顯著改善內(nèi)皮細(xì)胞活力(P＜0.05)，減少細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，IL-1β表達(dá)降低(P＜0.05);透射電鏡發(fā)現(xiàn)，HS干預(yù)OGD損傷的bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞后，可顯著減少線粒體破壞與溶解、細(xì)胞核皺縮等超微結(jié)構(gòu)。綜合上述的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)提示，HS對(duì)缺血缺氧損傷的BBB內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的保護(hù)效應(yīng)。

6、
　　為進(jìn)一步探討HS保護(hù)BBB內(nèi)皮細(xì)胞的非滲透性分子機(jī)制，我們通過高通量測(cè)序的方法發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，OGD組中bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)，并通過q-PCR驗(yàn)證了這一表達(dá)譜結(jié)果。按照這一測(cè)序結(jié)果，將bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞予40mmol/L的HS干預(yù)并作OGD處理，通過Western Blot、免疫組化以及免疫熒光等方法分析顯示，與OGD組相比，內(nèi)皮細(xì)胞的EGFR顯著下降(

7、P＜0.05)，同時(shí)細(xì)胞凋亡率和IL-1β表達(dá)明顯降低(P＜0.05);另外，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染過表達(dá)EGFR，予OGD處理后可顯著增加bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-1β(P＜0.05)，并增加凋亡率(P＜0.05)，但令人意外的是，HS并未顯著減少EGFR過表達(dá)后bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞的p-EGFR、IL-1β表達(dá)和凋亡率，原因可能為過表達(dá)EGFR后的BBB內(nèi)皮細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)功能受損，導(dǎo)致HS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)喪失。
　　結(jié)論: