二甲雙胍通過AMPK信號途徑抑制CD19 CAR-T細胞增殖及細胞毒性作用并促進其凋亡的研究.pdf

1、研究背景：
　　惡性腫瘤已經(jīng)成為危害人類生命健康、降低人們生活質(zhì)量的重要疾病之一，我國惡性腫瘤每年的發(fā)病率和死亡率均呈上升之勢，而外科手術(shù)治療、放療和化療等傳統(tǒng)治療方法惡性腫瘤都各有其弊端，治療后都會對患者的免疫力產(chǎn)生消極的影響，對于惡性程度較高、易復(fù)發(fā)且難治的惡性腫瘤缺乏有效的治療方法，因此，尋找一種新型的、有效的治療惡性腫瘤的方法勢在必行。
　　近年來，腫瘤細胞免疫治療越來越受到科學(xué)家和醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注。腫瘤細胞免疫治療

2、是一種自體細胞回輸?shù)倪^繼性免疫細胞治療手段，通過生物技術(shù)獲取腫瘤患者外周血中免疫細胞以及對患者免疫細胞的體外修飾，重新靜脈回輸至患者體內(nèi)，使機體重新獲得特異性殺傷惡性腫瘤細胞的能力。腫瘤細胞免疫治療最大的優(yōu)勢就是其安全性和有效性，回輸自體細胞避免了免疫排斥反應(yīng)，同時，免疫修飾使免疫細胞殺傷腫瘤細胞更精確，由此看來，腫瘤細胞免疫治療彌補了手術(shù)、化療和放療的缺點，為惡性腫瘤的徹底根治奠定了基礎(chǔ)?？乖逗鲜荏w(CAR)T細胞正是基于對患者外周

3、血T細胞進行基因修飾，回輸體內(nèi)從而實現(xiàn)自體細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷功能，因此，CAR-T細胞免疫治療已經(jīng)成為生物治療領(lǐng)域的關(guān)注重點，為復(fù)發(fā)、難治腫瘤患者帶來了治愈的希望;基于CD19在B淋巴細胞表面表達的特異性，CD19 CAR-T細胞治療已經(jīng)使不少患者達到了完全緩解，甚至治愈;但是，B淋巴細胞惡性腫瘤并非對CD19 CAR-T細胞治療均敏感，如何提高CD19 CAR-T細胞的治療效果成為很多專家學(xué)者研究的重點。
　　無論是在內(nèi)

4、分泌疾病還是腫瘤治療領(lǐng)域，糖代謝已經(jīng)成為其疾病發(fā)生發(fā)展中不可忽略的一個環(huán)節(jié)。目前，有研究表明糖代謝在腫瘤細胞的增殖和凋亡中也有著舉足輕重的影響。而糖代謝不僅影響腫瘤細胞的增殖和凋亡，其對免疫細胞功能的發(fā)揮也有重要的影響。二甲雙胍，作為Ⅱ型糖尿病一線用藥，在調(diào)節(jié)糖代謝和改善胰島素抵抗方面有著突出的優(yōu)勢，研究表明，二甲雙胍可以抑制腫瘤細胞糖代謝，從而抑制腫瘤細胞的生長，起到預(yù)防和治療的目的。然而，二甲雙胍對于CAR-T細胞的影響及作用機制迄

5、今無人探究，因此，本課題意在研究二甲雙胍對CD19 CAR-T細胞的影響，并探討作用機制。
　　研究目的：
　　研究二甲雙胍對CD19 CAR-T細胞增殖、凋亡及細胞毒性作用的影響，并探討其作用機制。
　　研究方法：
　　1.采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建PGK-EGFP-CD19 CAR慢病毒質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行病毒包裝，對人外周血T淋巴細胞進行慢病毒轉(zhuǎn)染，流式細胞儀檢測T細胞慢病毒轉(zhuǎn)染率;
　　2.CCK-8

6、細胞增殖實驗及細胞計數(shù)板計數(shù)法評估二甲雙胍對CD19 CAR-T細胞增殖的影響;
　　3.流式細胞儀檢測二甲雙胍對CD19 CAR-T細胞凋亡的影響;
　　4.CD19 CAR-T細胞與腫瘤細胞按照一定的效靶比(E∶T)共培養(yǎng)，流式細胞儀評估二甲雙胍對CD19 CAR-T細胞殺傷能力的影響，ELISA法檢測細胞因子的釋放;
　　5.Western blotting驗證二甲雙胍通過AMPK-mTOR-HIF1α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途

7、徑影響CD19CAR-T細胞增殖、凋亡及細胞毒性作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.二甲雙胍抑制CD19 CAR-T細胞增殖，并促進其凋亡;
　　2.二甲雙胍降低CD19 CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的能力，抑制其細胞因子的釋放;
　　3.二甲雙胍激活A(yù)MPK，進而抑制mTOR的表達，最終HIF1α表達下調(diào);
　　4.AMPK抑制劑逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的消極作用，但未影響mTOR及HIF1α的表達，二甲雙胍對CD19 C