Anti--miR-21對eNOS表達調節(jié)和血管生成的影響及相關機制研究.pdf

1、目的:前期研究發(fā)現，miR-21反義寡核苷酸(AS-miR-21)能顯著抑制AP1和eNOS蛋白表達，轉錄因子AP1在AS-miR-21對eNOS的表達調節(jié)中起重要作用。進一步研究anti-miR-21對AngⅡ刺激下內皮型一氧化氮合酶基因表達調節(jié)的分子機制及其對體外血管形成的影響。
　　1、研究anti-miR-21對AngⅡ刺激下內皮型一氧化氮合酶基因表達調節(jié)的分子機制;
　　2、探討anti-miR-21抑制AngⅡ刺

2、激下內皮細胞增殖、遷移的機制及其對體外血管形成的影響;
　　3、闡明內皮細胞增殖、遷移和血管形成的分子機制，深入探討anti-miR-21在心血管系統(tǒng)發(fā)育和心血管疾病中的作用。
　　方法:1、檢測anti-miR-21對AngⅡ刺激人臍靜脈內皮細胞eNOS和Ap1表達的影響
　　構建anti-miR-21高表達質粒，通過X-tremeGENE HP DNA轉染試劑將anti-miR-21質粒轉染入人臍靜脈內皮細胞(Hu

3、man umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內，根據實驗目的將HUVECs分為3組:對照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。采用硝酸還原酶法檢測細胞上清液的NO濃度;RT-PCR法分別檢測eNOS和AP1 mRNA表達水平、免疫組化和免疫印跡實驗（Western blotting）分別檢測eNOS和AP1蛋白表達情況。
　　2、檢測anti-miR-21對AngⅡ刺激下人臍

4、靜脈內皮細胞增殖、遷移和血管形成的影響
　　構建anti-miR-21高表達質粒，通過X-tremeGENE HP DNA轉染試劑將anti-miR-21質粒轉染入人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內，根據實驗目的將HUVECs分為3組:對照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。觀測HUVECs的增殖（四甲基偶氮唑鹽，MTT法）、遷移（細胞劃痕

5、實驗）、凋亡（流式細胞術）和血管形成（人工基底膜，Matrigel法）等生物學行為的改變。
　　3、檢測anti-miR-21對AngⅡ刺激下人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移和血管形成的分子機制
　　構建anti-miR-21高表達質粒，通過X-tremeGENE HP DNA轉染試劑將anti-miR-21質粒轉染入人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)內，根

6、據實驗目的將HUVECs分為3組:對照組、AngⅡ組和anti-miR-21+AngⅡ組。采用PCR法檢測經AngⅡ刺激后miR-21的表達情況;采用免疫印跡實驗分別檢測CD31和VEGFR2蛋白表達情況。
　　結果:1、與對照組比較，AngⅡ組HUVECs的AP1與eNOS mRNA和蛋白表達均增加(P＜0.05)，而轉染anti-miR-21對其mRNA和蛋白表達都起到抑制作用(P＜0.05)。
　　2、與對照組比較，A

7、ngⅡ組細胞增殖明顯上升(P＜0.05)，遷移數目上升(P＜0.05)，凋亡率下降(P＜0.05)，形成管腔能力增強，而轉染anti-miR-21均可對上述生物學行為起到抑制作用。
　　3、與對照組比較，AngⅡ刺激6h組和刺激24h組的miR-21 mRNA表達量均升高(P＜0.01)，但隨著刺激時間的增長，miR-21 mRNA表達量有所下降(P＜0.01);AngⅡ組HUVECs的CD31與VEGFR2蛋白表達均增加(P＜0

8、.05)，而轉染anti-miR-21對其蛋白表達都起到抑制作用(P＜0.05)。
　　結論:1、Anti-miR-21明顯抑制AngⅡ刺激下HUVECs eNOS的表達;轉錄因子AP1的參與可能是這一調節(jié)過程的重要分子機制之一。
　　2、Anti-miR-21明顯抑制AngⅡ刺激下HUVECs的增殖、遷移、凋亡和血管形成能力，并且與其調控eNOS的表達有關。
　　3、miR-21可能作為一個重要因子參與AngⅡ對內皮